一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇及其应用的制作方法

本发明属于工业微生物基因资源挖掘与遗传育种领域，具体涉及毒三素链霉中与利普斯他汀及其结构类似物合成有关的支链α酮酸脱氢酶复合物编码基因簇及其应用。

背景技术：

1、利普斯他汀是由毒三素链霉菌(streptomyces toxytricini)发酵产生的一种特异性肠胃道脂肪酶抑制剂，其分子结构中含有两个脂肪酸长链、一个反式中心β内酯环和一个氨基酸侧链。利普斯他汀的氢化还原产物奥利司他化学性质更加稳定，由罗氏公司开发成体重控制药物于1999年获批上市，至今已有超过20年的安全有效使用历史，是目前全球唯一的otc减重药和非中枢神经作用减重药，也是唯一可用于12岁以上青少年肥胖症治疗的减重药。

2、利普斯他汀作为微生物次级代谢产物，在发酵过程中会产生一些与其结构和理化性质相近的结构类似物，现已报道的大多数利普斯他汀结构类似物均具有相同的天然β内酯骨架结构，仅在脂肪酸长链上有所不同，主要表现在其两条长链脂肪酸中含有一条末端单甲基化的异式或反异式脂肪酸，甲基位于脂肪酸分子碳链骨架倒数第2个或第3个碳原子上，形成脂肪酸支链。本发明的申请人在前期研究中发现并鉴定了一种结构新颖的利普斯他汀结构类似物rrt0.90(hplc图谱中与利普斯他汀的相对保留时间为0.90)，与利普斯他汀具有相同的β内酯骨架和脂肪酸长链，唯一不同点为两种化合物骨架上酯键连接的氨基酸不同，其中利普斯他汀为甲酰化亮氨酸，rrt0.90则为甲酰化苯丙氨酸。

3、

4、含有β内酯结构的天然产物比较少见且具有良好的生物活性，按来源不同可分为萜类β内酯、脂肪酸和聚酮类β内酯、α-氨基-β内酯三类。脂肪酸和聚酮类β内酯化合物具有良好的脂肪酶抑制活性，利普斯他汀作为其典型代表已被开发成药。但利普斯他汀结构类似物在毒三素链霉菌发酵液中的含量极低，难以提取和制备，大大限制了对其深入研究和开发应用。利普斯他汀的生物合成已有大量的研究，但其完整的生物合成途径仍未完全阐明，有关利普斯他汀结构类似物的形成机制研究报道很少，而有关其结构类似物rrt0.90的形成机制未见任何报道。

技术实现思路

1、本发明为克服现有技术的不足，以利普斯他汀发酵过程中产生的rrt0.90结构类似物为目标分子，对利普斯他汀产生菌进行了全基因组测序、基因组再分析和代谢网络重构，在染色体上发现了并鉴定了与利普斯他汀及其结构类似物rrt0.90形成有关的支链α酮酸脱氢酶编码基因簇bkda2b2c2。所述基因簇包含bkda2，bkdb2和bkdc2三个结构基因和一个lrp/asnc转录调控基因bkdr。所述基因簇的结构示意图如附图1所示。

2、其中，所述基因bkda2，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.5所示。

3、所述基因bkdb2，其核苷酸序列如seq id no.2所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.6所示。

4、所述基因bkdc2，其核苷酸序列如seq id no.3所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.7所示。

5、所述基因bkdr，其核苷酸序列如seq id no.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.8所示。

6、本发明的目的之一在于提供一种敲除毒三素链霉菌中所述基因簇任意一个或多个基因以显著提高利普斯他汀结构类似物rrt0.90发酵水平的方法。通过敲除所述基因簇中的bkda2基因，bkdb2基因，bkdc2基因和bkdr基因中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因，可显著提高rrt0.90的发酵水平。

7、本发明的目的之二在于提供一种增强转录调控基因bkdr的表达以提高利普斯他汀发酵效价的方法。通过利用强启动子和增加基因拷贝数，在毒三素链霉菌中增强表达转录调控基因bkdr，可有效提高利普斯他汀的发酵效价。

8、本发明所述的毒三素链霉菌，包括但不限于本技术人公开发表的文献[李辉，方志锴，郭霞凌.利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌ap617-n12ca的全基因组测序与分析[j]，中国抗生素杂志，2022(1)：28-34]中记载的毒三素链霉菌ap617-n12ca。

9、本发明所述的提高结构类似物rrt0.90发酵水平的工程菌株构建方法，包括如下步骤：

10、1)目的基因敲除质粒的构建：以毒三素链霉菌基因组dna为模板，通过pcr扩增获得目的基因的同源重组左臂片段和右臂片段，将左臂片段和右臂片段插入到温敏型穿梭质粒pkc1139多克隆位点上，获得目的基因敲除质粒；

11、2)目的基因敲除质粒的接合转移：将目的基因敲除质粒转化大肠杆菌et12567(puz8002)，通过属间接合转移导入毒三素链霉菌，通过安普霉素和萘啶酮酸抗性筛选发生第一次同源重组使敲除质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株。

12、3)目的基因敲除突变株的筛选与鉴定：将单交换菌株在不添加抗生素的斜面培养基上松弛传代后分离单菌落，同时影印到添加安普霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上，筛选在普通平板上生长而在抗性平板上不生长的安普霉素敏感型双交换突变株。然后通过同源重组模型设计特定引物，利用pcr方法对敏感菌株进行测序和筛选，最终得到基因缺失的双交换突变株。

13、4)目的基因敲除突变株的发酵与产物分析：将出发菌株和目的基因敲除图突变株分别进行发酵，分离纯化发酵液，同批次进行hplc分析发酵产物变化情况。

14、所述目的基因为前述bkda2基因，bkdb2基因，bkdc2基因和bkdr基因中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因。基因bkda2，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.5所示。基因bkdb2，其核苷酸序列如seq id no.2所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.6所示。基因bkdc2，其核苷酸序列如seq idno.3所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.7所示。基因bkdr，其核苷酸序列如seqid no.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.8所示。

15、本发明所述的提升利普斯他汀发酵效价的工程菌株构建方法，包括如下步骤：

16、1)整合型表达载体构建：以毒三素链霉菌基因组dna为模板，通过pcr扩增得到所述转录调控基因片段，通过酶切酶连的方法连入整合型质粒pib139的ndei/xbai位点，得到整合型表达质粒pib139-bkdr，pib139-bkdr包含有红霉素抗性基因强启动子perme*以及完整的bkdr基因，还含有质粒转移所需原件和及噬菌体的整合酶和整合位点。

17、2)接合转移与强化表达菌株筛选：将所述整合型表达质粒转化大肠杆菌et12567(puz8002)，通过属间接合转移导入毒三素链霉菌，通过安普霉素抗性筛选整个pib139-bkdr载体特异性整合进入毒三素链霉菌染色体的重组强化表达菌株。

18、所述的转录调控基因为前述的bkdr基因，其核苷酸序列如seq id no.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.8所示。

19、本发明所述基因簇的应用，是指通过对所述基因簇中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因进行敲除构建得到的工程菌，以及对所述基因簇中的转录调控基因进行强化表达构建的工程菌，在适用于利普斯他汀产生的条件下进行发酵培养，用于生产或制备利普斯他汀或其结构类似物rrt0.90。将工程菌依次经摇瓶种子培养、种子扩大培养和发酵培养基培养后生产或制备利普斯他汀或其结构类似物rrt0.90，发酵产物经分离纯化后可进一步合成奥利司他或其衍生物。包括含有seq id no.1-4的任意核苷酸序列的基因和或含有选自seq idno.4-8的任意氨基酸序列的多肽均适用于生产或制备利普斯他汀或结构类似物rrt0.90。

20、有益效果：本发明在毒三素链霉菌染色体上鉴定了与利普斯他汀及其结构类似物rrt0.90合成有关的基因簇bkda2b2c2。通过对基因簇bkda2b2c2中的bkda2，bkdb2，bkdc2和bkdr中的至少一个进行失活，可显著提升利普斯他汀结构类似物rrt0.90的发酵水平，为制备新的利普斯他汀衍生物的研究奠定基础。通过对基因簇bkda2b2c2中的转录调控基因bkdr强化表达，可有效提高利普斯他汀的发酵效价，降低生产成本。