一种胰腺正常类器官培养基及胰腺癌类器官筛选培养基的制作方法

本发明涉及类器官培养，具体涉及一种胰腺正常类器官培养基及胰腺癌类器官筛选培养基配方。

背景技术：

1、胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤，由于缺乏合适的筛查和诊断早期胰腺癌的医疗手段，组织活检困难，肿瘤发生发展快，化疗应答率低，手术切除率低及术后易复发，导致胰腺癌的发病率与死亡率基本一致，五年的生存率极低。胰腺癌极具侵袭性的疾病性质和患者的低存活率，使其成为严重的全球疾病负担。因此，建立理想的胰腺癌临床前研究模型，在模型中模拟人类胰腺癌细胞的恶性转化，浸润，侵袭，远处转移等病理过程，探索其关键的分子机制、丰富诊疗手段，以及改善胰腺癌患者的预后具有重要的意义，是胰腺癌基础研究的热点课题。

2、目前广泛使用的临床前研究模型有两种，传统2d肿瘤细胞系的培养和肿瘤异种移植动物模型，但其都具有一定的缺陷。第一种，传统2d肿瘤细胞系，具有操作简单，成本低，药物筛选高通量的优势，但是单克隆来源的2d细胞系，在长期培养过程中丧失了肿瘤的异质性，无法模拟患者体内肿瘤的复杂结构及病理特征。第二种，肿瘤异种移植动物模型，该模型可以模拟亲本肿瘤的特征，维持肿瘤异质性，但其构建周期长，种属差异大，不适合药物筛选高通量化。

3、自2009年hans clevers实验室培育出首个微型肠道类器官，类器官在最近的十几年间飞速发展。2015年，胰腺癌类器官在hans clevers实验室被成功培育。胰腺癌是指将患者穿刺或者手术切除的组织在基质胶培养数周得到的类器官，胰腺癌的类器官高度保持患者肿瘤的异质性，为个性化精准医疗，再生医学领域提供了良好的实验技术平台。目前，国内关于胰腺癌类器官的相关专利一共有两篇，分别是中山大学孙逸仙纪念医院的“一种分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法”和中国医学科学院北京协和医院的“一种人胰腺癌组织类器官模型的构建”。两篇专利的关注点在建立胰腺癌组织类器官上，并没有提到胰腺正常类器官污染的问题。但是，正常细胞的污染在癌症类器官培养体系中是普遍存在的。例如，前列腺癌，肠癌。利用类器官技术培养前列腺癌细胞的实验方案已经建立，并且效果良好[wenxian,(karthaus et al.cell 2014；(159):163-175；drost et al.natprotoc2016；(2):347-58]，但是建立前列腺癌类器官时，从前列腺癌组织中提取到的细胞经常被正常/健康的前列腺细胞污染。

4、由于正常类器官生长速度比癌类器官生长速度快，在长期培养过程中，正常类器官的占比会逐渐升高，直至完全覆盖癌类器官，导致所培养的胰腺癌类器官失去了患者的肿瘤特性，使得利用类器官实验的药敏测试与患者实际的药物敏感性有所偏差，对临床用药产生误导，延误患者选择有效精准药物有的时间。

5、综上所述，避免胰腺癌类器官中正常类器官的污染是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

2、为此，本发明第一方面提供一种胰腺正常类器官培养基，所述培养基包括基础培养基组分和添加剂组分，其中，所述添加剂包含fgf2、fgf7、igf-1且不包含fgf10。

3、本发明中优化的培养基配方去除了fgf10的同时添加了fgf2、fgf7、igf-1，有利于胰腺正常类器官的存活和生长。

4、根据本发明的一些实施方案，所述fgf2的浓度为5-200ng/ml，优选为10-100ng/ml。

5、根据本发明的一些实施方案，所述fgf7的浓度为10-500ng/ml，优选为10-200ng/ml。

6、根据本发明的一些实施方案，所述igf-1的浓度为10-500ng/ml，优选为10-200ng/ml。

7、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括egf。

8、根据本发明的一些实施方案，所述egf的浓度为10-200ng/ml，优选为20-100ng/ml。

9、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括nicotinamide、pge2。

10、根据本发明的一些实施方案，所述nicotinamide的浓度为2-20mm，优选为5-15mm。

11、根据本发明的一些实施方案，所述pge2的浓度为0.1-3μm，优选为0.5-5μm。

12、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括noggin、wnt-3a、r-spondin-1。

13、根据本发明的一些实施方案，所述noggin的浓度为10-500ng/ml，优选为20-200ng/ml。

14、根据本发明的一些实施方案，所述wnt-3a的浓度为10-500ng/ml，优选为50-200ng/ml。

15、根据本发明的一些实施方案，所述r-spondin-1的浓度为100-1000ng/ml，优选为200-500ng/ml。

16、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括a83-01、n-乙酰半胱氨酸、y-27632、gastrin。

17、根据本发明的一些实施方案，所述a83-01的浓度为100-1000nm，优选为200-500nm。

18、根据本发明的一些实施方案，所述n-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1-3mm，优选为0.5-2mm。

19、根据本发明的一些实施方案，所述y-27632的浓度为2-20μm，优选为5-15μm。

20、根据本发明的一些实施方案，所述gastrin的浓度为2-20nm，优选为5-10nm。

21、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括hepes、glutamax、b27、青霉素/链霉素双抗溶液。

22、根据本发明的一些实施方案，所述hepes的浓度为1-30mm，优选为10-20mm。

23、根据本发明的一些实施方案，所述glutamax的浓度为1-10mm，优选为1-5mm。

24、根据本发明的一些实施方案，所述b27的浓度为1％-10％(v/v)，优选为1％-5％(v/v)。

25、根据本发明的一些实施方案，所述青霉素/链霉素双抗溶液的浓度为0.1％-4％(v/v)，优选为0.1％-2％(v/v)。

26、根据本发明的一些实施方案，所述基础培养基包括选自advanced dmem/f12、ham’s f-12、silac advanced dmem/f-12flex、dmem/f-12、william's e营养混合物中的任意一种。

27、本发明第二方面提供所述培养基在培养胰腺类器官中的用途。

28、本发明第三方面提供一种胰腺癌类器官筛选培养基，所述培养基包括基础培养基组分和添加剂组分，其中所述添加剂包含egfr抑制剂且不包含egf。

29、发明人寻找到了胰腺正常类器官生长所必需的关键因子egf，和能够抑制正常胰腺类器官生长的化合物egfr抑制剂，例如吉非替尼。去除egf和添加egfr抑制剂的条件培养基能够有效的阻断正常胰腺类器官的生长，伴随着类器官传代的过程，癌类器官的纯度大幅度提升，为胰腺癌类器官建立了尽可能纯净的类器官。

30、根据本发明的一些实施方案，所述egfr抑制剂包括吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、来那替尼、吡咯替尼中的至少一种。

31、根据本发明的一些实施方案，所述egfr抑制剂为吉非替尼，所述吉非替尼的浓度为0.5-50μm，优选为1-10μm。

32、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂包括nicotinamide、igf-1、fgf2、fgf7、pge2。

33、根据本发明的一些实施方案，所述nicotinamide的浓度为2-20mm，优选为5-15mm。

34、根据本发明的一些实施方案，所述igf-1的浓度为10-500ng/ml，优选为10-200ng/ml。

35、根据本发明的一些实施方案，所述fgf2的浓度为5-200ng/ml，优选为10-100ng/ml。

36、根据本发明的一些实施方案，所述fgf7的浓度为10-500ng/ml，优选为10-200ng/ml。

37、根据本发明的一些实施方案，所述pge2的浓度为0.1-3μm，优选为0.5-5μm。

38、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括：noggin、wnt-3a、r-spondin-1。

39、根据本发明的一些实施方案，所述noggin的浓度为10-500ng/ml，优选为20-200ng/ml。

40、根据本发明的一些实施方案，所述wnt-3a的浓度为10-500ng/ml，优选为50-200ng/ml。

41、根据本发明的一些实施方案，所述r-spondin-1的浓度为100-1000ng/ml，优选为200-500ng/ml。

42、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂进一步包括：a83-01、n-乙酰半胱氨酸、y-27632、gastrin。

43、根据本发明的一些实施方案，所述a83-01的浓度为100-1000nm，优选为200-500nm。

44、根据本发明的一些实施方案，所述n-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1-3mm，优选为0.5-2mm。

45、根据本发明的一些实施方案，所述y-27632的浓度为2-20μm，优选为5-15μm。

46、根据本发明的一些实施方案，所述gastrin的浓度为2-20nm，优选为5-10nm。

47、根据本发明的一些实施方案，所述添加剂包括：hepes、glutamax、b27、青霉素/链霉素双抗溶液。

48、根据本发明的一些实施方案，所述hepes的浓度为1-30mm，优选为5-20mm。

49、根据本发明的一些实施方案，所述glutamax的浓度为1-10mm，优选为1-5mm。

50、根据本发明的一些实施方案，所述b27的浓度为1％-10％(v/v)，优选为1％-5％(v/v)。

51、根据本发明的一些实施方案，所述青霉素双抗溶液的浓度为0.1％-4％(v/v)，优选为0.1％-2％(v/v)。

52、根据本发明的一些实施方案，所述基础培养基包括选自advanced dmem/f12、ham’s f-12、silac advanced dmem/f-12flex、dmem/f-12、william's e营养混合物中的任意一种。

53、本发明第四方面提供所述的培养基在筛选胰腺癌类器官中的用途。

54、本发明第五方面提供一种筛选胰腺癌类器官的方法，所述方法包括：

55、1)将胰腺癌样本进行消化处理，以便获取胰腺癌细胞团；

56、2)利用第三方面所述的培养基培养所述胰腺癌细胞团，以便筛选胰腺癌类器官。

57、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。