靶向CD47和PD-L1的双特异性抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及抗体及免疫，更具体地涉及靶向特异性结合于cd47及pd-l1两者的双特异性抗体，其编码核酸、组合物及其用于诊断及治疗的用途。

背景技术：

1、cd47蛋白又称整合素相关蛋白(iap)，属于igg超家族的一个五次跨膜糖蛋白，广泛表达于不同组织细胞。

2、1、靶向cd47-sirpa的抗体在抗肿瘤治疗中的作用机制

3、肿瘤细胞逃避免疫识别和清除依赖于多种过程，包括诱导免疫抑制肿瘤微环境和降低肿瘤细胞免疫原性。肿瘤细胞免疫逃逸的一个关键机制是通过过度表达免疫抑制信号分子cd47。cd47被广泛认为是一种“不要吃我”的信号，它有助于在生理条件下维持非恶性细胞的免疫耐受性，但这种分子可以帮助不同癌症类型的癌细胞存活。癌细胞利用cd47的“不要吃我”的功能，在表面表达的cd47水平高于非恶性细胞；cd47可与配体tsp-1或sirpα结合，调控不同的细胞功能，包括细胞迁移、粘附、凋亡，轴突延伸，细胞因子产生及t细胞激活。sirpα是一个含有典型免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)跨膜蛋白，主要表达于髓系造血细胞膜表面，如巨噬细胞，树突状细胞等。cd47与sirpα结合后，导致itims的磷酸化，从而招募shp-1/shp-2，进而抑制肌球蛋白iia在吞噬突触的积累，最终抑制吞噬细胞的吞噬功能。在许多癌症类型中，与信号调节蛋白α(sirpα)结合的cd47启动抑制性信号通路，导致恶性细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用。抑制癌细胞中cd47信号的疗法可能会促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，从而限制肿瘤生长。大量研究表明，cd47在不同类型的肿瘤中过度表达，包括骨髓瘤、平滑肌肉瘤、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤，乳腺癌，骨肉瘤，头颈部鳞状细胞癌。cd47高表达水平与癌症恶化的治疗反应和预后相关。抑制癌细胞中cd47信号的疗法可能会促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，从而限制肿瘤生长，这为抗肿瘤治疗提供了可行的免疫靶点。

4、由于在肿瘤细胞表面过表达cd47可以帮助这些细胞逃避免疫细胞的监视和清除，cd47成为新的抗肿瘤药物开发的一个极具吸引力的靶标，其中抗cd47抗体可以阻断cd47-sirpα抑制信号并促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，并且可通过多种不同的机制发挥其抗肿瘤作用。鉴于cd47的广泛表达和cd47-sirpα信号能够使恶性细胞逃避巨噬细胞介导的吞噬作用，抑制cd47-sirpα信号轴是一种很有前途的癌症治疗策略。

5、靶向cd47-sirpa治疗的临床进展

6、目前，一些已进入临床试验cd47特异性靶向抗体或药物，包括hu5f9-g4(forty-seven)、cc-90002(celgene)、tti-621(trillium)、alx148(alexo therapeutics)、srf231(surface oncology)、shr-1603(恒瑞)和ibi188(innovent biologics)等。

7、2、pd-l1及cd47的相关性

8、pd-l1及cd47均在肿瘤细胞中呈现高表达，并且能够被myc同步调节。肿瘤细胞表达的myc能够通过作用于先天性和获得性免疫细胞以及细胞因子来调节肿瘤微环境，激活myc可以上调cd47及pd-l1的表达(myc可以直接作用于cd47及pd-l1的启动子，进而调节其mrna、蛋白的表达水平)，进而导致免疫抑制及肿瘤增生

9、3、现有技术问题

10、cd47亦表达于健康细胞，诸如末梢血液中的红细胞(rbc)及血小板上，cd47药物在调动巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的同时，不可避免地误伤了人体红细胞，且由单克隆抗体阻断cd47-sirpα相互作用已展示耗乏彼等细胞，在一些情况下引起剂量限制毒性，因此，初代cd47药物在临床上出现了包含溶血性贫血在内的严重副作用，cd47单抗疗法遇到一系列生物安全性问题。

11、尽管阻断肿瘤或抗原呈递细胞上pd-l1与t细胞上的pd-1结合的抗pd-l1免疫疗法在患有多种类型的癌症(例如nsclc、rcc、hcc、hnscc、淋巴瘤、梅克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma))的患者中具有效果，然而，即使在此等抗pd-l1敏感性肿瘤类型中，许多患者对治疗仍无反应。除上文所列的肿瘤类型以外，具有低抗pd-(l)1敏感性的许多其他肿瘤类型亦富集cd47。鉴于当前抗cd47抗体及抗pd-l1抗体治疗剂的各种局限性，需要改良的靶向cd47及pd-l1的双特异性分子，其中既能刺激巨噬细胞产生吞噬作用，又能阻断pd-1信号通路，两种机制一起发挥作用，强化对肿瘤细胞的杀伤力同时降低与红细胞上表达的cd47结合的可能性，因此降低cd47药物的毒性的cd47/pd-l1双特异性抗体新产品，成为肿瘤免疫治疗领域及其有前景的发展方向。cd47和其他免疫检查点靶点的双抗类药物成为除了改良cd47的红细胞结合特异之外的另一重要cd47靶向药物改良方向。目前癌症治疗领域仍需要性能不断改进的cd47/pd-l1双抗特异性抗体。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服当前抗cd47抗体及抗pd-l1抗体单一治疗剂的各种局限性，及在在临床中高浓度施用cd47抗体情况下与红细胞上的cd47结合引起红细胞溶血和血液凝集的临床缺陷。

2、本发明提供了具有新结构的同时靶向结合cd47和pd-l1、具有良好的cd47和pd-l1靶点特异性结合能力和阻断cd47与sirpa结合和阻断pd-l1与pd-1结合的能力，同时与pd-l1的亲和性强于与cd47的亲和性的，并且选择性的与肿瘤细胞结合而不与人红细胞结合，不会引起人红细胞凝集，且副作用较小的的双特异性抗体或抗原结合片段及其应用。此外，本发明采用了包含“杆入臼”(knobs-into-holes)结构的对称igg样双特异抗体结构，实现不同重链以及轻链的正确装配，增加双特异抗体的产率，易于在体外的培养细胞中稳定表达和纯化，不需要复杂的生产工艺。

3、本发明的第一方面提供了一种双特异抗体或抗原结合片段，其包括cd47特异性的结合臂a和pd-l1特异性的结合臂b，其中，，所述结合臂a包含源自抗cd47抗体或抗原结合片段的轻链a(la)、重链a(ha)和连接所述轻链a(la)、重链a(ha)的接头1(x1)和，所述结合臂b包含源自抗pd-l1抗体或抗原结合片段的轻链b(lb)、重链b(hb)和连接所述轻链b(lb)、重链b(hb)的接头2(x2)，其中，所述重链a(ha)和所述重链b(hb)相互作用形成fih结构，所述结合臂a和所述结合臂b通过所述kih结构形成异二聚体。在一些实施方案中，所述结合臂a中，所述重链a(ha)包含重链可变区a(vha)和所述轻链a包含轻链可变区a(vla)；其中，

4、(1)所述vha包含或选自(a1)、(a2)和(a3)：

5、(a1)如seq id no:22-28任一项所示的氨基酸序列；

6、(a2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

7、(a3)与(a1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

8、在一些实施方案中，所述结合臂a中，所述重链a包含重链可变区a(vha)和所述轻链a包含轻链可变区a(vla)，其中,

9、(2)所述vla包含或选自选自(a4)、(a5)和(a6)

10、(a4)如seq id no:57-63任一项所示的氨基酸序列；

11、(a5)(a4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

12、(a6)与(a4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

13、在一些实施方案中，根据本发明双特异性抗体，其包含cd47特异性的结合臂a和pd-l1特异性的结合臂b，所述抗结合臂a包含重链可变区a和轻链可变区a，其中：

14、一些实施方案中，所述pd-l1特异性的结合臂b包含重链可变区b(vhb)和轻链可变区b(vlb)；其中，所述vhb包含或选自：

15、(b1)如seq id no:85所示的氨基酸序列；

16、(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

17、(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和/或

18、所述vlb包含或选自：

19、(b4)如seq id no:86所示的氨基酸序列；

20、(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和

21、(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

22、一些实施方案中，所述双特异性抗体包含cd47特异性结合臂a和pd-l1特异性结合臂b,所含cd47特异性结合臂a包含重链可变区a(vha)和轻链可变区a(vla),其中：

23、所述vha包含如seq id no:22所示的氨基酸序列；

24、所述vla包含如seq id no:57任一项所示的氨基酸序列；

25、所述pd-l1特异性的结合臂b包含重链可变区b(vhb)和轻链可变区b(vlb)；其中，所述vhb包含如seq id no:85所示的氨基酸序列；所述vlb包含如seq id no:86所示的氨基酸序列。

26、一些实施方式中，所述双特异性抗体中，所述所述重链a(ha)包含如seq id no:29-35任一项所示的氨基酸序列，或与seq id no:29-35任一项所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；所述轻链a(la)包含如seq id no:64-70任一项所示的氨基酸序列，或与seq id no:64-70任一项所示的氨基酸序列至少90％同源性的氨基酸序列；所述重链b(hb)包含如seq id no:87所示的氨基酸序列，或与seq id no:87所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；所述述轻链b(lb)包含如seq id no:88所示的氨基酸序列，或与seq id no:154所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

27、一具体实施方式中，所述cd47特异性的结合臂a包含seq id no：29所示的氨基酸序列的重链和seq id no:64所示的氨基酸序列的轻链；和/或

28、所述pd-l1特异性地结合臂b包含seq id no：87所示氨基酸序列的重链和seq idno：88所示氨基酸序列的轻链。

29、在一些实施方案中，其中，所述重链a包括重链可变区a(vha)，所述轻链a包括轻链可变区a(vla),

30、其中，所述重链可变区a(vha)包含(a)-(d)中一种或多种氨基酸序列：

31、(a)vha cdr1，其包含如seq id no:1-7任一项所示的氨基酸序列，或与seq idno:1-7任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

32、(b)vha cdr2，其包含如seq id no:8-14任一项所示的氨基酸序列，或与seq idno:8-14中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

33、(c)vha cdr3，其包含如seq id no:15-21所示的氨基酸序列，或与seq id no:15-21所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

34、(d)与(a)-(c)任一项所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和/或

35、所述轻链可变区a(vla)包含(e)-(h)中一种或多种氨基酸序列:

36、(e)vla cdr1，其包含如seq id no:36-42中任一项所示的氨基酸序列；

37、(f)vla cdr2，其包含如ats所示的氨基酸序列；

38、(g)vla cdr3，其包含如seq id no:50-56中任一项所示的氨基酸序列；

39、(h)与(e)-(g)任一项所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

40、在一些实施方案中，所述结合臂a包含重链可变区a(vha)，所述重链可变区a包含vha cdr1、vha cdr2、vha cdr3；其中vha cdr1包含如seq id no:1-7中任一项所示的氨基酸序列；vha cdr2包含如seq id no:8-14中任一项所示的氨基酸序列；vha cdr3包含如seqid no:15-21所示的氨基酸序列。

41、在一些实施方案中，所述结合臂a包含轻链可变区a(vla)，所述轻链可变区a包含vla cdr1、vla cdr2和vla cdr3；其中vla cdr1包含如seq id no:36-42中任一项所示的氨基酸序列；vla cdr2包含如ats所示的氨基酸序列；vla cdr3包含如seq id no:50-56中任一项所示的氨基酸序列。

42、在一些实施方案中，所述结合臂a包含vha和vla；所述vha包含vha cdr1、vhacdr2、vha cdr3；所述vla包含vla cdr1、vla cdr2和vla cdr3。其中，vha cdr1包含如seqid no:1-7中任一项所示的氨基酸序列；vha cdr2包含如seq id no:8-14中任一项所示的氨基酸序列；vha cdr3包含如seq id no:15-21所示的氨基酸序列；vla cdr1包含如seq idno:36-42中任一项所示的氨基酸序列；vla cdr2包含如ats所示的氨基酸序列；vla cdr3包含如seq id no:50-56中任一项所示的氨基酸序列。

43、一实施方式中，本发明的的双特异性抗体中，所述特异性结合pd-l1的结合臂b包含重链可变区b(vhb)和轻链可变区b(vlb),

44、其中，所述vhb包含(i)-(l)中一种或多种cdrs氨基酸序列：

45、(i)vhb cdr1，其包含如seq id no：80所示的氨基酸序列，或与seq id no:80所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

46、(j)vhb cdr2，其包含如seq id no:81所示的氨基酸序列，或与seq id no:81所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

47、(k)vhb cdr3，其包含如seq id no:82所示的氨基酸序列，或与seq id no:82所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

48、(l)与(i)-(k)任一项所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和/或

49、一实施方式中，本发明的的双特异性抗体中，所述特异性结合pd-l1的结合臂b包含的重链可变区vhb和轻链可变区vlb,其中所述vlb包含(m)-(p)中一种或多种cdrs氨基酸序列：

50、(m)vlb cdr1，其包含如seq id no:83所示的氨基酸序列，或与seq id no:83所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

51、(n)vlb cdr2，其包含如sas所示的氨基酸序列；

52、(o)vlb cdr3，其包含如seq id no:84所示的氨基酸序列，或与seq id no:84所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

53、(p)与(m)-(o)任一项所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

54、在一些实施方案中，所述结合臂b包含所述vhbcdr1、vhbcdr2、vhb cdr3、vlbcdr1、vlb cdr2和vlb cdr3。

55、一实施方式中，本发明的双特异抗体或抗原结合片段中，其中，所述结合臂a还包含重链恒定区a(cha)和轻链恒定区a(cla),所述重链恒定区a(cha)包含如seq id no:75所示氨基酸序列或与seq id no:75所示氨基酸序列具有不低于80％，或不低于85％，或不低于90％，或不低于95％，或不低于98％，或不低于99.5％，或不低于99.8％序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列，和所述轻链恒定区(cla)包含如seq id no:73所示氨基酸序列或与seq id no:73所示氨基酸序列具有不低于80％，或不低于85％，或不低于90％，或不低于95％，或不低于98％，或不低于99.5％，或不低于99.8％序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列，,所述结合臂b分别包含重链恒定区b(chb)和轻链恒定区b(clb)，所述链恒定区b(chb)包含seq id no:90所示氨基酸序列或与seq id no:90所示氨基酸序列具有不低于80％，或不低于85％，或不低于90％，或不低于95％，或不低于98％，或不低于99.5％，或不低于99.8％序列同一性的氨基酸序列，氨基酸序列，所述轻链恒定区b(clb)包含如seq idno:89所示的氨基酸序列或与seq id no:89所示氨基酸序列具有不低于80％，或不低于85％，或不低于90％，或不低于95％，或不低于98％，或不低于99.5％，或不低于99.8％序列同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。

56、一实施方式中，本发明的双特异抗体或抗原结合片段中，所述结合臂a还包含如seq id no:75所示的重链恒定区a(cha)和如seq id no:73所示的轻链恒定区(cla),所述结合臂b分别包含seq id no:90所示的重链恒定区b(chb)和seq id no:89所示的轻链恒定区b(clb)。

57、一方面，本发明提供一种双特异抗体或抗原结合片段，其包括cd47特异性的结合臂a和pd-l1特异性的结合臂b，其中所述结合臂a包含重链可变区a(vha)和轻链可变区(vla)和位于重链可变区a(vha)和轻链可变区(vla)之间的接头1(x1),所述结合臂b包含重链可变区b(vhb)和轻链可变区b(vlb)和位于重链可变区b(vhb)和轻链可变区b(vlb)之间的接头2(x2)；其中，所述重链可变区a(vha)和所述轻链可变区(vla)配对形成cd47抗原结合位点，所述重链可变区b(vhb)、轻链可变区b(vlb)配对形成pd-l1抗原结合位点。

58、一方面，本发明提供一种双特异抗体或抗原结合片段，其包含特异性结合cd47的结合臂a和特异性结合pd-l1的结合臂b；其中，

59、所述结合臂a包含scfab(a)和fc(a)，所述scfab(a)包含源自抗cd47抗体的轻链可变区a(vla)、轻链恒定区a(cla)、重链可变区a(vha)和第一重链恒定区a(ch1a)，以及连接所述轻链恒定区a(cla)和所述重链可变区a(vha)的接头1(x1)，所述scfab(a)包含如seqid no:77所示的氨基酸序列，或与seq id no:77所示的氨基酸序列具有不低于80％序列同一性的氨基酸序列；和/或，

60、所述结合臂b包含scfab(b)和fc(b),所述scfab(b)包含抗pd-l抗体的轻链可变区b(vlb)、轻链恒定区b(clb)、重链可变区b(vhb)和第一重链恒定区b(ch1b)，以及连接所述轻链恒定区b(clb)和所述重链可变区b(vhb)的接头2(x2)，所述scfab(b)包含如seq idno:93所示的氨基酸序列，或与seq id no:93所示的氨基酸序列具有不低于80％序列同一性的氨基酸序列。

61、一实施方式中，所述scfab(a)和fc(a)融合为特异性结合cd47的单链肽链a；所述scfab(b)和fc(b)融合为特异性结合pd-l1的单链肽链b.

62、其中，所述重链a或重链b任一经过氨基酸修饰形成knob结构，另一经过氨基酸修饰形成hole结构，所述cd47特异性的结合臂a和所述pd-l1特异性的结合臂b通过所述knob和所述hole之间形成kih结构，所述cd47特异性的结合臂a和pd-l1特异性的结合臂b通过所述knob和所述hole之间形成所述kih结构形成异二聚体；

63、在一实施方式中，其中，所述fc(a)包含如seq id no：78所示的氨基酸序列或与seq id no:78所示的氨基酸序列具有不低于80％序列同一性的氨基酸序列，所述fc(b)包含如seq id no：94所示的氨基酸序列或与seq id no:94所示的氨基酸序列具有不低于80％序列同一性的氨基酸序列。

64、一实施方式中，所述fc(a)经过氨基酸修饰形成hole结构，所述fc(b)经过氨基酸修饰形成hole结构,所述knob和所述hole之间形成kih结构促进所述结合臂a和所述结合臂b形成异二聚体。

65、一实施方式中，所述fc(b)经过氨基酸修饰形成knob结构，所述fc(a)经过氨基酸修饰形成hole结构，所述knob和所述hole之间形成kih结构促进所述结合臂a和所述结合臂b形成异二聚体。

66、一实施方式中，所述cd47结合臂包含seq id no:90所示重链恒定区cha，所示cha包含seq id no:78所示的fc(a),所述fc(a)包含在第三重链恒定区a(ch3a)形成hole结构的氨基酸修饰。

67、一实施方式中，所述pd-l1结合臂包含seq id no:90所示的重链恒定区chb,所述chb包含seq id no:94所示的fc(b),所述fc(b)包含在第三重链恒定区b(ch3b)形成knob结构的氨基酸修饰。

68、一实施方式中，所述形成hole结构的氨基酸修饰和形成所述knob结构的氨基酸修饰包括s354c和t366w和y349c、t366s、l368a和y407v中的一种，两种或多种。

69、一实施方式中，所述形成hole结构的氨基酸修饰包括s354c和t366w；所述形成knob的氨基酸修饰包括y349c、t366s、l368a和y407v中的一种，两种或多种。

70、一方面，本发明提供一种双特异抗体或抗原结合片段，其包括特异性结合cd47的结合臂a和特异性结合pd-l1的结合臂b,其中，所所述特异性结合cd47的结合臂a包括源自抗cd47抗体或其变体的轻链可变区a(vla)、源自抗cd47抗体或其变体的轻链恒定区a(cla)、源自抗cd47抗体或其变体的重链可变区a(vha)和源自抗cd47抗体或其变体的重链恒定区a(cha)；所述特异性结合cd47的抗原结合臂为n端到c端包含式vla-cla-x1-vha-cha所示的结构，

71、其中，所述”-“为肽键，

72、所述x1为接头结构；所述x1包含如seq id no:74所示的氨基酸序列；

73、所述特异性结合cd47的结合臂a包含如seq id no:79所示的氨基酸序列，或包含和seq id no:79所示氨基酸序列具有高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98.5％或最优选高于99.5％序列同源性的氨基序列；所述cla包含如seq id no:73所示的氨基酸序列，或包含和seq id no:73所示氨基酸序列具有高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98.5％最更优选高于99.5％序列同源性的氨基序列；所述cha包含如seq id no:75所示的氨基酸序列，或包含和seq id no:75所示氨基酸序列具有高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98.5％或最优选高于99.5％序列同源性的氨基序列；

74、和/或

75、所述特异性结合pd-l1的结合臂b包含源自抗pd-l1抗体或其变体的轻链可变区b(vlb)、源自抗pd-l1抗体或其变体的轻链恒定区b(vlb)、源自抗pd-l1抗体或其变体的重链可变区b(vhb)和源自抗pd-l1抗体或其变体的重链恒定区b(chb)；所述特异性结合pd-l1的抗原结合臂b为n端到c端包含式vlb-clb-x2-vhb-chb所示的结构，

76、其中，所述“-”为肽键，所述x2为接头结构；所述x2如seq id no:91所示；

77、所述靶向pd-l1的抗原结合臂b包含如seq id no:95所示氨基酸序列，或和seq idno:95所示氨基酸序列具有高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98.5％或最优选高于99.5％序列同源性的氨基序列；

78、其中，所述clb包含如seq id no:89所示的氨基酸序列，或包含和seq id no:89所示氨基酸序列具有高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98.5％或优选高于99.5％序列同源性的氨基序列；

79、所述chb包含如seq id no:90所示的氨基酸序列，或包含和seq id no:90所示氨基酸序列具有高于80％，优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98.5％或更最优选高于99.5％序列同源性的氨基序列。

80、一些实施方案中，本发明的双特异抗体或抗原结合片段中，所述抗cd47抗体的轻链恒定区a(cla)和所述抗pd-l1抗体的轻链恒定区b(clb)任选κ链或λ链恒定区，所述述cha和所述chb任选igg1或igg4恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗cd47和pd-l1双特异抗体包含鼠源或人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗cd47和pd-l1双特异抗体包含包含鼠或人源igg1，igg2，igg3或igg4或其变体的重链恒定区。

81、在一些优选实施方案中，本发明的抗cd47和pd-l1双特异抗体为人源化抗体，其中所述重链包含人源的igg1、igg2、igg3、igg4或其变体的重链恒定区，所述轻链包含人源的κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

82、一些示例性实施方案中，所述抗cd47抗体的轻链恒定区cla和所述抗pd-l1抗体的clb任选人抗体κ链或λ链恒定区，所述述重链恒定区cha和所述chb任选人抗体igg1或igg4恒定区。

83、在一些优选实施方案中，本发明的抗cd47和pd-l1双特异抗体为人源化抗体，其中所述重链包含任选人igg1、igg2、igg3、igg4或其变体的重链恒定区，所述轻链包含任选人κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

84、在一示例性实施方那中，本发明的抗cd47和pd-l1双特异抗体为人源化抗体，其中所述重链包含任选人igg1重链恒定区，所述轻链包含任选人κ或其变体的轻链恒定区。

85、在一示例性实施方那中，本发明的抗cd47和pd-l1双特异抗体为人源化抗体，其中所述重链包含任选人igg1重链恒定区，所述轻链包含任选人λ或其变体的轻链恒定区。

86、一些实施方案中，所述抗原结合片段选自fab、fab′-sh、fv、scfv或(fab′)2片段,或，所述抗原结合片段均选自fab和(fab′)2、scfab。

87、再一方面，本发明提供分离的编码前述方面人源化cd47抗体、双特异性抗体或抗原结合片段的多聚核苷酸，其包含：(1)编码结合臂a的重链或轻链的多核苷酸；(2)编码结合臂b的重链或轻链的多核苷酸；(3)编码结合臂a的重链可变区a(vha)或轻链可变区a(vla)的多核苷酸；或(4)编码结合臂b的种重链可变区b(vhb)或轻链可变区b(vlb)的多核苷酸；(5)编码knob结构的多核苷酸；(6)编码hole结构的多核苷酸。

88、一些实施方式中，本发明提供分离的编码前述方面人源化cd47抗体、双特异性抗体或抗原结合片段的多聚核苷酸，其包含：(1)编码如seq id no：64-70任一项所述的结合臂a或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的轻链的核苷酸序列；(2)编码如seq id no:29-35任一项所述的结合臂a的重链或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(3)编码如seq id no：79所示的结合臂a或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列：(4)编码如seq id no：95所示结合臂b或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(5)编码如seq id no:77所示的scfab(a)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(6)编码如seqid no：93所示的scfab(b)的核苷酸序列；(7)编码如seq i no：57-63任一项所示的轻链可变区a(vha)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(8)编码如seq i no：22-28任一项所示的编码重链可变区b(vhb)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；

89、或

90、所述多聚核苷酸包含：(1)编码如seq id no:29所述的结合臂a的轻链a(la)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列,(2)编码如seq id no:64所示的结合臂a的重链a(ha)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(3)编码如seq id no：88所述的结合臂b的轻链b(lb)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列,(4)编码如seq id no：87所述的结合臂b的重链b(hb)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(3)如seq id no：106所示的编码如seq id no：179所示的结合臂a或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列：(4)如seq id no：107所示的编码如seq id no：95所示结合臂b或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(5)如seq id no：77所示的scfab(a)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(6)编码如seq idno：93所示的scfab(b)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(7)如seq id no：96所示的编码如seq i no：57所示的轻链可变区a(vha)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(8)如seq id no：99所示的或与其同源性不低于90％的编码如seq i no：22所示的编码重链可变区a(vha)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列。

91、再一方面，本发明提供表达载体，其包含编码如前述方面那任一项所述的抗体或抗原结合片段的多聚核苷酸；(7)如seq id no:101所示所示或与其同源性不低于90％的核苷酸序列的编码如seq i no:86所示氨基酸序列或的轻链可变区b(vhb)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列；(8)如seq id no:104所示或与其同源性不低于90％的核苷酸序列所示的编码如seq i no:85所示的编码重链可变区b(vhb)或与其至少90％序列同源性的具有相同功能的变体的核苷酸序列。。

92、再一方面，本发明提供包含编码如本发明前述的抗体或抗原结合片段的多聚核苷酸，或前述的表达载体的生产本发明所述双特异性抗体的重组生产细胞。

93、再一方面，本发明提供产生本发明前述所述的包含特异性结合cd47和特异性结合pd-l1的双特异性抗体或抗原结合片段的方法，其包含：

94、在引起产生前述的双特异性抗体的条件下培养根据权利要求的宿主细胞，及纯化所产生的双特异性抗体。

95、再一方面，本发明提供一种组合物，其包含如发明前述方面所述的双特异性抗体或抗原结合片段、多聚核苷酸、表达载体或权细胞，以及药学上可接受的载体。

96、再一方面，本发明提供前述任方面所述的双特异性抗体或抗原结合片段、的多聚核苷酸、表达载体所述的细胞和组合物在制备治疗cd47和pd-l1同时过度表达相关疾病的药物中的应用。

97、一些实施方式中，所述与cd47和pd-l1同时过度表达相关的疾病包括或选自自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病、癌症。

98、再一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，包括向需要治疗的患者施用有效剂量的上述的双特异抗体或抗原结合片段、上述的多聚核苷酸、或上述的表达载体、上述的细胞或上述的组合物，其中，优选的，所述疾病为与cd47和pd-l1同时过度表达相关的疾病

99、再一方面，本发明涉及试剂盒或制品，其包含上述的双特异抗体或抗原结合片段、上述的多聚核苷酸或上述的表达载体。

100、再一方面，本发明提供了双特异抗体或抗原结合片段及其应用，本发明的双特异抗体或抗原结合片段可以结合肿瘤细胞表面的cd47和pd-l1抗原。本发明抗体或抗原结合片段可以用于治疗或预防各种疾病，比如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病、癌症，也可以用于相关疾病的诊断和预后。

101、在一些实施方式中，本文提供一种抑制或减少个体中癌细胞生长的方法，该方法包含向个体施用有效量的本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物。

102、在一些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体和相同施用量的于ab-cd47和pd-l1单抗联合用药之间相比较，具有协同作用。

103、在一些实施方式中，本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物，其用于本文所提供的治疗方法中。在一些实施方式中，本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物，其用于治疗个体的癌症和/或增强个体免疫反应。

104、在一些实施方式中，本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物在制造用于本文所提供的治疗方法中的药剂中的用途。在一些实施方式中，所述药剂用于治疗个体的癌症和/或增强个体免疫反应。

105、在一些实施方案中，所述疾病是与pd-l1和cd47过度表达相关的病症。在一些实施方式中，所述疾病是自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)、癌症。

106、在一些实施方案中，所述疾病是与pd-l1和cd47相关的病症包括但不限于各种血液病和实体瘤，如在一个实施方案中，所述癌症是胃肠道癌，如结肠癌。

107、其中，所述肿瘤疾患包括血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，所述血液瘤为急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人t-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；所述实体瘤为淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤中的至少一种。

108、有益效果

109、本发明提供了同时特异性结合cd47的人源化cd47抗体和同时靶向结合cd47和pd-l1的双特异性抗体及其抗原结合片段、变体。该双特异性抗体分子产生如下优势功能:

110、(1)基于cd47和pd-l1双免疫检查点阻断的机理，可以高亲和力的靶向结合cd47和pd-l1；

111、(2)该双特异性抗体在结合人cd47蛋白的同时，也能够阻断的cd47与sirpα结合，在结合人pd-l1的同时也能够阻断pd-l1与pd1的结合，从而提高对肿瘤的抑制作用；

112、(3)具有不低于抗cd47单抗和抗pd-l1单抗的抗体介导的adcc效应；

113、(4)在抑制肿瘤细胞增殖的作用具有协同的抗肿瘤效果，该双特异性抗体比单独使用抗cd47单抗和pd-l单抗单独使用和联合用药使用具有更好的协同的抗肿瘤治疗疗效，从而能够提高同时表达cd47和pd-l1的肿瘤的治疗效果；

114、(5)本发明的双特异性抗体制备工艺通过采用kih和两个结合臂的ch1和ch2之间形成多对二硫键，有效防止了两个靶向的轻链和重链错配，可有效提高目标cd47/pd-l1双特异性抗体的得率；

115、(6)本发明的同时靶向结合cd47和pd-l1的双特异性抗体在抗肿瘤治疗中比使用单一靶点的单抗联合用药具有更低的经济成本和更好的患者口服依从性，相比cd47单抗可避免结合红细胞和引起红细胞凝集的副作用，具有更良好的安全性；

116、(7)本发明的人源化cd47抗体和同时靶向结合cd47和pd-l1的双特异性抗体与食蟹猴cd47蛋白有种属交叉结合活性，与大鼠cd47蛋白、小鼠cd47蛋白没有种属交叉结合活性，与大鼠、小鼠和食蟹猴pd-l1蛋白均有种属交叉结合活性。

117、(8)明显抑制肿瘤生长，且不具有明显的红细胞毒性，人源化后的抗体免疫原性大大降低，有效消除人体免疫系统对外源性单抗的排异反应，可在制备用于治疗各类肿瘤疾病的药物中应用，具有广阔的市场前景。