一种间插Gibson组装的OE-PCR扩增方法

本发明属于基因工程，涉及一种间插gibson组装的oe-pcr扩增方法。

背景技术：

1、目前，重叠延伸pcr(overlapextensionpcr，oe-pcr)是常用的分子生物学技术，多用于dna片段融合与基因定点突变。一般做法是将具有重叠序列的两个dna片段经变性-退火后互补-延伸形成融合dna，再以之为模板指数扩增。也有三个或更多dna片段同步进行的做法，可用于多片段融合与克隆基因多位点突变。科研工作者都有类似经历：短dna片段oe-pcr容易实现；长dna片段oe-pcr融合困难；多dna片段一次性oe-pcr融合成功的希望较小。遇到这类问题时可以尝试多种优化方案：如调整重叠序列长度，摸索退火温度，调整反应体系的缓冲液成分等。也可以两步法运行oe-pcr程序，即先行无引物热循环以期两个dna片段能充分重叠-延伸，再进行有引物运行让融合dna指数扩增。此外，某些纳米材料和核内小分子也可以起到pcr增效剂的作用。然而，上述处理的作用有限，因其中缺乏特定规律，往往反复调整反应条件亦不能达到预期的dna片段融合扩增效果。科研工作者亟需一种稳定有效的oe-pcr解决方案。

2、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：针对长基因或多dna片段的oe-pcr成功率低，且缺乏稳定有效的解决方案。

3、gibson组装最早由danielg.gibson及其同事于2009年提出，利用taqdna连接酶、t5核酸外切酶和phusiondna聚合酶的协同作用，在同一试管中、同一温度下对含有重叠末端序列的dna片段进行快速拼接。分析oe-pcr融合与gibson组装过程，会发现两者各有优势。对于oe-pcr融合困难的基因，利用gibson组装将dna片段先行拼接，再进行指数扩增是一种有效解决方案。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种间插gibson组装的oe-pcr扩增方法，该方法尤其在涉及长基因及多dna片段oe-pcr时优势较为显著。

2、本发明是这样实现的，在常规oe-pcr较为困难的时候，如长基因及多dna片段的oe-pcr融合，在获取各基因片段后，将基因片段等比例混合进行gibson组装，再直接以组装混合物作为模板进行第二轮pcr扩增；在前后两轮pcr之间插入一次gibson组装过程，使得dna片段在较为温和的条件下更容易形成融合基因模板，以便在第二轮pcr中指数扩增。

3、进一步，间插gibson组装的oe-pcr扩增方法包括以下步骤：

4、步骤一，进行引物设计与合成；；

5、步骤二，进行第一轮pcr扩增；

6、步骤三，将dna片段进行gibson组装；

7、步骤四，进行第二轮pcr扩增；

8、步骤五，进行dna产物的鉴定与序列分析。

9、进一步，步骤一中，引物采用primerpremier5.0软件设计，经page纯化。

10、进一步，步骤一中，引物s1的核苷酸序列为seq id no：1，引物s2的核苷酸序列为seq id no：2，引物s3的核苷酸序列为seq id no：3，引物s4的核苷酸序列为seq id no：4，引物s5的核苷酸序列为seq id no：5，引物sb的核苷酸序列为seq id no：6，引物sb0的核苷酸序列为seq id no：7，引物sc的核苷酸序列为seq id no：8，引物sc0的核苷酸序列为seq idno：9，引物srb的核苷酸序列为seq id no：10，引物srb780的核苷酸序列为seq id no：11，引物arb780的核苷酸序列为seq id no：12，引物srb1295h的核苷酸序列为seq id no：13，引物srb1786x的核苷酸序列为seq id no：14，引物arb1295h的核苷酸序列为seq id no：15，引物arb1786x的核苷酸序列为seqidno：16，引物arb的核苷酸序列为seq id no：17，引物ac3的核苷酸序列为seq id no：18。

11、进一步，步骤二中的dna扩增包括：

12、第一轮pcr：取pegfp_c1-rb质粒1ng稀释到9.6μlddh2o中，加入上、下游引物各0.2μl，加入10μl2×pcrtaqmix。pcr产物经电泳检测后切取目标条带回收至30μlddh2o中，并分别进行双片段组装和三片段组装；以等量ddh2o替代2×assemblymix作负对照，50℃孵育1h，而后94℃5min使酶失活。

13、第二轮pcr：取0.5μl组装物或正、负对照，加入10μl2×pcrtaqmix，上下游引物各0.2μl；根据预期dna长度添加1～2.5μldntp，补水至20μl。

14、进一步，第一轮pcr运行程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃2min，30循环。

15、进一步，双片段组装为：上、下游片段各2μl，2×assemblymix4μl。

16、进一步，三片段组装为：f1、f2及f3片段各2μl，2×assemblymix6μl。

17、进一步，第二轮pcr运行程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃3min，30循环。

18、进一步，步骤三中的dna片段的酶切鉴定与序列分析包括：pcr产物经电泳检测后切取目标条带回收至20μlddh2o中；取10μl回收物加2μl10×buffer，0.5μl内切酶，补水至20μl；37℃孵育2h；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。选取适量dna回收物进行序列测定，采用dnaman4.0软件进行序列比对。

19、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

20、第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

21、为了提高常规情况下较困难的oe-pcr扩增效率，本发明提供的间插gibson组装的pcr扩增方法是在前后两轮pcr之间插入一次gibson组装过程以便于dna在较温和的温度下形成融合基因模板，以便在第二轮pcr中指数扩增。以克隆视网膜母细胞瘤基因定点突变为例进行说明。即在获取各基因片段之后，先将其等比例混合进行gibson组装，再直接以组装混合物作为模板进行第二轮pcr扩增。在双片段融合检测过程中，随着基因片段长度增加，直接oe-pcr效率逐渐降低；而间插gibson组装后仍能保持较高的扩增效率。在三片段融合检测过程中，本发明的组装物中出现完整的融合基因，它作为pcr的良好模板，保证了第二轮pcr扩增的顺利实现。由于组装试剂中t5核酸外切酶对dna末端的消化，第二轮pcr引物匹配位点应适当内移方能保证扩增效率。本发明将重叠延伸pcr与gibson组装有机结合，能实现长基因或多基因片段的有效融合，以利于基因融合或定点突变。

22、第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

23、本发明将gibson组装与oe-pcr有机结合，提供一种稳定有效的基因融合或基因定点突变解决方案。本发明的组装产物无需作电泳分离，甚至无需额外的dna纯化即可作为后续pcr模板，可能影响dna片段稳定性的t5核酸外切酶在随后的pcr高温变性阶段失活，故本发明不会使其较常规oe-pcr过于繁琐。

24、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

25、(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

26、目前市场上的基因定点突变试剂盒大多以滚环扩增法为基本原理。该试剂盒严重依赖其中dna聚合酶与dpnⅰ内切酶的活性。随着试剂盒存储时间延长或使用次数增加，不易察觉的酶活降低势必严重影响突变效率。

27、结合本发明可开发相应的基因定点突变试剂盒，其中的主要成分是热稳定性高保真dna聚合酶和gibson组装成分。该试剂盒性能较常规oe-pcr优越，又克服了基于滚环扩增法试剂盒的主要缺陷，可作为相关科研、检测领域工作者的良好选择。

28、(2)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：

29、对于常用的基因工程技术之oe-pcr，科研工作者都有类似经历：短dna片段oe-pcr容易实现；长dna片段oe-pcr融合困难；多dna片段一次性oe-pcr融合成功的希望较小。遇到这类问题时可以尝试多种优化方案：如调整重叠序列长度，摸索退火温度，调整反应体系的缓冲液成分等。也可以两步法运行oe-pcr程序，即先行无引物热循环以期两个dna片段能充分重叠-延伸，再进行有引物运行让融合dna指数扩增。然而，上述处理的作用有限，因其中缺乏特定规律，往往反复调整反应条件亦不能达到预期的dna片段融合扩增效果。科研工作者亟需一种稳定有效的oe-pcr解决方案。本发明所提供的间插gibson组装的oe-pcr方法可以稳定有效地解决上述技术难题。