一种可离子化脂质化合物及其脂质纳米颗粒的制作方法

本发明属于生物医药和生物，特别涉及一种可离子化脂质化合物及其脂质纳米颗粒。

背景技术：

1、外源生物分子和一些药物分子很难穿透细胞膜到达细胞质达到治疗效果，如mrna是一类高负电荷的生物分子，必须克服细胞膜的屏障，才能翻译成蛋白发挥生物功能，因此，这类生物分子的治疗应用在体内高效递送是一重要挑战。

2、脂质纳米颗粒(lnp)是一新型的核酸生物分子递送技术，lnp为核酸生物分子提供了保护外壳，以mrna为例，lnp既可以保护mrna不被rna酶分解，又可保护mrna分子不被tlrs识别，避免先天免疫系统的过度激活的作用；lnp因作为covid-19mrna疫苗递送平台的巨大成功而备受关注。

3、可离子化脂质化合物能够影响lnp的整体配方和生物学特性，是lnp中的关键组分，可与mrna自组装成病毒大小的颗粒，并可将mrna从内涵体释放到细胞质中，达到治疗或免疫效果。

4、在过去的50年里，大量的系统性研究致力于设计理想的可离子化脂质化合物，其中一些可离子化脂质化合物已被fda批准用于核酸分子的递送，如可离子化脂质化合物dlin-mc3-dma、sm-102与alc-0315。

5、然而，还需要大量的研究设计能够高效递送不同类型核酸分子的低毒可离子化脂质化合物。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，发现新颖的、高递送效率和低毒的可离子化脂质化合物，第一方面，本发明提供了一种可离子化脂质化合物，包括乙醇胺头基、一条溴代酸酯分叉尾链与另一条溴代酸酯直尾链或分叉尾链，所述的可离子化脂质化合物为如下结构式所示化合物中的一种或多种：

2、

3、第二方面，本发明提供了第一方面可离子化脂质化合物的制备方法，包括如下步骤：

4、s1、第一条溴代酸酯分叉尾链的制备：溴代酸与醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第一条溴代酸酯分叉尾链；

5、s2、取代的((2-羟乙基)氨基)酸酯的制备：乙醇胺头基与s1中得到的第一条溴代酸酯分叉尾链在高温常压下发生sn2亲核取代，将乙醇胺头基与第一条溴代酸酯分叉尾链连接起来得到取代的((2-羟乙基)氨基)酸酯；

6、s3、第二条溴代酸酯直尾链或分叉尾链的制备：溴代酸与醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第二条溴代酸酯直尾链或分叉尾链；

7、s4、将s2中制备的取代的((2-羟乙基)氨基)酸酯与s3中制备的第二条溴代酸酯直尾链或分叉尾链在高温常压下发生sn2亲核取代反应得到所述的可离子化脂质化合物。

8、第三方面，本发明在第一方面可离子化脂质化合物的基础上，提供了一种脂质纳米颗粒，所述的脂质纳米颗粒包括第一方面所述的可离子化脂质化合物。

9、所述的脂质纳米颗粒还包括核酸分子与辅助分子；所述核酸分子包括rna、mrna、sirna、dna中的一种或多种；所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000的至少一种或多种；

10、在一些实施例中，所述核酸分子为rna病毒全基因组rna正链或rna病毒全基因组rna负链或fluc-mrna或新型冠状病毒刺突蛋白mrna或dna病毒全基因组核酸dna或ii型单纯疱疹病毒gd包膜糖蛋白mrna中的一种；

11、在一些实施例中，所述可离子化脂质化合物和辅助分子的摩尔比例是可离子化脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000为50：10：38.5：1.5；

12、优选的，所述脂质纳米颗粒的粒径为60～100nm。

13、所述脂质纳米颗粒能够将核酸分子递送至肝脏或脾脏。

14、第四方面，本发明提供了一种具有溶瘤活性的脂质纳米颗粒，包括第一方面所述的可离子化脂质化合物与第三方面所述的rna病毒全基因组rna正链或rna病毒全基因组rna负链或dna病毒全基因组核酸dna或ii型单纯疱疹病毒gd包膜糖蛋白mrna，形成具有溶瘤活性的脂质纳米颗粒。

15、第五方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒的制备方法，用于制备第三方面所述的脂质纳米颗粒，包括如下步骤：

16、s5、脂质体原料溶液的制备：将可离子化脂质化合物与辅助分子按照可离子化脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000为50：10：38.5：1.5的摩尔比例进行溶解混合；

17、s6、核酸制剂的制备：将第三方面所述的核酸分子溶解在ph4.0～6.0的20～30mm的醋酸钠缓冲液中，核酸分子的浓度约为0.06mg/ml～0.15mg/ml；

18、s7、脂质纳米颗粒的制备：将s5中制备的脂质体原料溶液和s6中制备的核酸制剂快速混匀，形成均一稳定的脂质纳米颗粒；脂质体原料溶液与核酸制剂的体积比为2：1～6：1；脂质体原料溶液与核酸制剂的混匀总速率为8～20ml/min；

19、s8、脂质纳米颗粒ph环境的转变：快速地将脂质纳米颗粒的溶液环境从s6中ph4.0～6.0转变成ph7.0～7.4；将转变成ph7.0～7.4的脂质纳米颗粒浓缩至200～400mm。

20、优选的，在一些实施例中，s6核酸制剂的制备中ph值为5.0；醋酸钠缓冲液的浓度为25mm；核酸分子的浓度为0.1mg/ml。

21、优选的，在一些实施中，s7中脂质体原料溶液与核酸制剂的体积比为4：1；脂质体原料溶液与核酸制剂的混匀总速率为12ml/min。

22、第六方面，本发明提供了第一方面所述的可离子化脂质化合物在制备细胞转染试剂、新型冠状病毒疫苗或药物、溶瘤病毒药物或抗肿瘤药物中的应用。

23、第七方面，本发明提供了第三方面所述的脂质纳米颗粒在制备细胞转染试剂、新型冠状病毒疫苗或药物、溶瘤病毒药物或抗肿瘤药物中的应用。

24、第八方面，本发明提供了一种疫苗或药物，所述疫苗或药物包括第一方面所述的可离子化脂质化合物。

25、所述疫苗或药物为注射剂；通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内注射、灌注方式或静脉注射方式给药。

26、在一些实施例中，优选的，所述的给药方式为通过局部肌肉或静脉注射方式给药。

27、第九方面，本发明提供了一种溶瘤病毒药物，包括第四方面所述的具有溶瘤活性的脂质纳米颗粒。

28、第十方面，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗或药物，包括第一方面所述的可离子化脂质化合物与新型冠状病毒刺突蛋白mrna；所述可离子化脂质化合物与辅助分子包封新型冠状病毒刺突蛋白mrna。

29、第十一方面，本发明提供了一种细胞转染试剂，所述细胞转染试剂包括第一方面所述的可离子化脂质化合物与fluc-mrna；所述可离子化脂质化合物与辅助分子包fluc-mrna。

30、本发明提供了一种新的可离子化脂质化合物，丰富了可离子化脂质化合物种类，为提供新的疫苗或药物，如溶瘤病毒药物、新型冠状病毒疫苗或药物、细胞转染试剂提供了更多的选择，其形成的脂质纳米颗粒大小均匀、稳定性好、包封效率高、递送效率高且毒性低，对溶瘤病毒药物、新型冠状病毒疫苗或药物、细胞转染试剂及抗肿瘤药物等领域的发展和应用具有重要的意义。

31、本发明提供的包括所述可离子化脂质化合物的脂质纳米颗粒，可通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内以及灌注等多种给药方式，还可通过静脉注射等全身给药方式，将核酸分子如fluc-mrna或新型冠状病毒刺突蛋白mrna或ii型单纯疱疹病毒gd包膜糖蛋白mrna递送到体内，甚至可以靶向肝脏或脾脏，在体内细胞中有效表达治疗性蛋白药物或抗原，起到预防或治疗疾病的作用。此外，本发明的脂质纳米颗粒适合于递送核酸分子如新型冠状病毒刺突蛋白mrna进入体内行使预防性或治疗性疫苗的功能。