一种聚合物包覆水滑石固定化核酸酶P1、制备方法及其用途

本发明属于生物工程，具体涉及一种聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1、制备方法及其用途。

背景技术：

1、酶催化具有高效、专一、条件温和的特点，目前在医药、食品等行业都有着广泛的应用。

2、酶催化中用的酶包括游离酶和固定化酶。游离酶在催化过程中对环境要求较高，且不易回收，从而限制了其在工业催化中的连续使用。固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。酶经过固定化后对酶的催化性能产生影响，其本身的结构必将受到扰动，同时其参与的催化反应也由均相体系变为固一液两相体系固定化酶是解决酶工业化应用问题的重要手段之一。

3、例如核酸酶p1是一种含锌金属酶，其于1957年从桔青霉发现，能水解rna和热变性的dna，从而得到5’-核苷酸或5’-脱氧核苷酸，并对磷酸基团有特异性，这也是核酸酶p1在工业上主要应用。由于核苷酸是一类重要的化学品，在母婴用品以及医疗用药领域都有着不可取代的作用，因此对酶的研究越来越受到本领域技术人员的关注，具有重大的研究价值和工业价值。

4、cn104232613b公开了一种固定化核酸酶及其制备方法，由核酸酶和固相载体组成，核酸酶通过共价键与固相载体上的基团相连接。具体制备方法是将sepharose-4b凝胶，于g3砂芯漏斗内抽去保护液，称湿重50g凝胶sepharose-4b，用500ml，0.5mol/lnacl溶液淋洗，用蒸馏水洗净；称取15g brcn，加入15ml乙腈将其溶解；50g凝胶加入75ml 0.2mol/l，ph10.0的na2co3-nahco3缓冲液，置冰浴中，缓慢搅拌；向烧杯内滴加brcn溶液使它与sepharose-4b凝胶反应，同时滴加6mol/l naoh，使反应液中的ph维持在10.0；将brcn加完后继续反应5分钟，此时反应液中的ph不再下降，维持在10.0，停止反应；将活化反应物迅速转移到g3砂芯漏斗内抽滤，预冷的蒸馏水淋洗，最后浸泡在100ml 0.1mol/l，ph9.5的na2co3-nahco3缓冲液中准备偶联；核酸酶溶液浓缩到10mg/ml以上，对0.1mol/l，ph9.5的na2co3-nahco3缓冲液充分透析，测定蛋白浓度10mg/ml；50ml核酸酶溶液加入已经活化处理好的sepharose-4b凝胶，混匀，在4℃振荡偶联24小时，终止偶联；将偶联物转移到g3砂芯漏斗内，用500ml，0.5mol/lnacl溶液抽滤，淋洗；凝胶用500ml蒸馏水洗，用150ml0.1mol/l甲酸-0.5mol/l氯化钾，ph2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至ph6.5，其中所述的核酸酶为粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶。然而该专利的缺陷使用共价键固定化酶，固定过程中酶偶联率低，每克载体仅能负载十几毫克酶，且酶活回收率差等，导致了此技术不能大规模实际应用。

5、cn106591274b公开了一种固定化核酸酶p1的制备方法，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体，其中表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶p1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5～6g/l核酸酶p1酶液中，核酸酶p1与树脂的质量比为10～250mg：1g，混合，在25℃振荡反应时间2～12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶p1。然而该专利同样存在核酸酶的负载量较低等缺陷。

6、因此，开发一种固定化核酸酶p1的制备工艺，使得得到的固定化核酸酶p1的酶活回收率得到70％以上，稳定可重复利用，

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1，以剥离的水滑石纳米薄片为载体，利用水滑石层板带正电的特性，通过静电作用使核酸酶p1固定在水滑石纳米薄片上；再使聚合物单体在水滑石固定化核酸酶p1的表面进行聚合反应，对其进行包覆形成核壳结构。本发明通过聚合物包覆水滑石固定化的核酸酶p1，形成限域空间多级结构，增加了核酸酶p1的稳定性，重复使用五次固定化核酸酶p1后，酶活回收率达到70％以上。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1，所述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p是以剥离的水滑石纳米薄片为载体，利用水滑石层板带正电的特性，通过静电作用使核酸酶p1固定在所述水滑石纳米薄片上，再使聚合物单体在水滑石固定化核酸酶p1的表面进行聚合反应，从而对所述水滑石固定化核酸酶p1进行包覆形成的核壳结构。

4、进一步地，所述聚合物单体、所述水滑石、所述核酸酶p1的质量比为1-6：1：1.5-4。

5、进一步地，所述聚合物包括苯乙烯、α-氰基丙烯酸乙酯、n-异丙基丙烯酰胺、壳聚糖中的一种或几种的混合物。

6、进一步地，所述水滑石纳米薄片通过将氨基酸插层水滑石分散在去co2的去离子水中，配制成浓度为1～4mg/ml，在n2气氛下经超声4～12h、分散、剥离得到。

7、进一步地，所述氨基酸插层水滑石的具体制备步骤为：称取二价金属盐与三价金属盐溶于去离子水中配置混合溶液a；称取naoh溶于去离子水中配置溶液b；称取氨基酸溶于去离子水中配置溶液c；所述二价金属盐与三价金属盐、氨基酸摩尔配比为(2～3)：1：1；在n2气氛下，将溶液a和b同时滴加入溶液c，维持ph在8～10，滴加完成后在40～100℃下搅拌6～12h，离心干燥得所述氨基酸插层水滑石。

8、进一步地，所述二价金属盐为硝酸镁、硝酸锌、硝酸镍、硝酸钴中的一种或多种。

9、进一步地，所述三价金属盐为硝酸铁、硝酸铝中的一种或两种。

10、进一步地，所述氨基酸为l-丙氨酸、l-亮氨酸、l-丝氨酸、l-苯丙氨酸、l-组氨酸中的一种或多种。

11、水滑石是一类层状的化合物，其层间阴离子能够交换，层板阳离子可以进行调节。水滑石的制备方法主要包括共沉淀法，水热法和成核晶化隔离法。目前水滑石的应用十分广泛，可作为固体碱催化剂应用于多种有机合成反应，且在抗菌，阻燃剂等材料中也发挥着重要作用。此外，由于水滑石具有良好的生物相容性，因此也常作为载体来进行酶的固定化。

12、聚α-氰基丙烯酸乙酯是一类人体可降解的高分子材料，具有亲和性、抗菌性以及无毒性的特点。α-氰基丙烯酸乙酯的聚合可以以水为引发剂，常温下即可进行，其形貌随着聚合时间以及单体含量的增加由无规则变为球形再变为棒状的形态。通过聚α-氰基丙烯酸乙酯的包覆可以形成限域空间，增加固定化酶的稳定性。

13、苯乙烯价格低廉，能通过自由基聚合形成聚苯乙烯，研究表面可以通过调控引发剂以及单体的量等条件来控制聚苯乙烯微球的粒径大小。

14、n-异丙基丙烯酰胺是一种热门的智能温敏性材料，通过自由基聚合可形成温敏性凝胶，在药物运输，诊断等方面有着重要发应用。

15、壳聚糖具有活泼的氨基基团，使得其具有优异的生物学性能，是一类具有巨大潜能的功能性生物材料，广泛应用于农业，化妆品，环保等领域。

16、本发明还提供一种前述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1的制备方法，包括如下步骤：

17、步骤1水滑石纳米薄片的制备：

18、称取一定量的二价金属盐和三价金属盐，以氨基酸为层间阴离子，通过共沉淀法制备能氨基酸插层水滑石；将所述氨基酸插层水滑石分散于去co2的去离子水中，经超声分散剥离得到所述水滑石纳米薄片胶体；

19、步骤2水滑石固定化核酸酶p1的制备：

20、将步骤1得到的水滑石纳米薄片胶体与0.5～20mg/ml的核酸酶p1溶液混合，核酸酶p1与水滑石纳米薄片的质量比为0.5～10；在10～40℃下震荡反应2～10h，通过离心、冷冻、干燥得水滑石固定化核酸酶p1；

21、步骤3聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1的制备：

22、将步骤2得到的水滑石固定化核酸酶p1分散于溶剂中，在搅拌下逐滴加入聚合物单体，聚合物单体与水滑石固定化核酸酶p1的投料比为0.15～15mg：1mg，搅拌聚合时间为10～120min，洗涤干燥后得到固定化核酸酶p1。

23、步骤1中，共沉淀法合成氨基酸插层水滑石步骤如下：

24、称取二价金属盐与三价金属盐溶于去co2的去离子水中得到溶液a，称取naoh溶于去co2的去离子水中得到溶液b，称取氨基酸溶于去co2的去离子水中得到溶液c，在n2气氛及搅拌的条件下，将溶液a和溶液b同时滴入溶液c，并控制ph恒定在6～11。

25、进一步地，所述二价金属盐为硝酸镁、硝酸锌、硝酸镍、硝酸钴中的一种或多种。

26、进一步地，所述三价金属盐为硝酸铁、硝酸铝中的一种或两种。

27、进一步地，所述氨基酸为l-丙氨酸、l-亮氨酸、l-丝氨酸、l-苯丙氨酸、l-组氨酸中的一种或多种。

28、进一步地，步骤1中，所述二价金属盐与三价金属盐和氨基酸的摩尔比为(2～3)：1：1；优选地，所述摩尔比为2：1：1。

29、进一步地，步骤1中，所述二价金属盐的摩尔浓度为1～2mol/l；优选地，所述摩尔浓度为1mol/l。

30、进一步地，步骤1中，所述三价金属盐的摩尔浓度为0.1～1mol/l；优选地，所述摩尔浓度为0.5mol/l。

31、进一步地，步骤1中，所述naoh的摩尔浓度为0.1～2mol/l；优选地，所述摩尔浓度为1mol/l。

32、进一步地，步骤1中，所述氨基酸的摩尔浓度为10～100mmol/l；优选地，所述摩尔浓度为50mmol/l。

33、进一步地，步骤1中，所述水滑石分散到去co2的去离子水中，分散浓度为1～4mg/ml；优选地，所述浓度为2mg/ml。

34、进一步地，步骤1中，所述水滑石分散于去co2的去离子水后，持续通入0.5～3h的n2。

35、进一步地，步骤2中，所述水滑石固定化核酸酶p1的具体步骤如下：

36、用醋酸与醋酸钠配置成0.1～1mol/l的ph为4～6的醋酸缓冲溶液；将核酸酶p1溶于上述醋酸缓冲溶液中形成浓度为0.5～20mg/ml的核酸酶p1溶液；将上述核酸酶p1溶液与水滑石纳米薄片胶体以体积比为1：(1～3)进行混合，在10～40℃下震荡反应2～10h，离心干燥得水滑石固定化核酸酶p1。

37、进一步地，步骤2中，所述水滑石固定化核酸酶p1是通过离心、冷冻、干燥的方法得到的。其中，冷冻温度为-65℃，预冻2-5h后，在压力0.1-5pa下冷冻干燥5-10h。此步骤中，先进行2-5小时的预冻步骤，将所述水滑石固定化核酸酶p1冷冻成固体形态的时间，然后进行5-10小时的冷冻干燥的步骤，即抽真空以后使固体升华的时间。

38、进一步地，步骤3中，所述溶剂为乙酸乙酯，乙醇，水，异丙醇，液体石蜡中的一种或几种的混合物；所述聚合物单体为苯乙烯，α-氰基丙烯酸乙酯，n-异丙基丙烯酰胺，壳聚糖中的一种或几种的混合物。

39、进一步地，步骤3中，所述水滑石固定化核酸酶p1分散于溶剂中后，继续搅拌15～30min。

40、进一步地，步骤3中，所述聚合物单体的滴加速度为15～30滴/分钟。

41、进一步地，步骤3中，所述聚合物单体的聚合温度为20～60℃。

42、本发明进一步还提供一种前述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1用于水解rna生产核苷酸的用途。

43、进一步地，所述用途包括如下步骤：取5％rna于试管中，再向试管中加入0.2mol/l、ph 5.0的醋酸缓冲液进行混合，然后将试管水浴加热到70℃并水浴维持10min，加入所述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1，继续反应15min，反应结束后加入等体积核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵和2.5％过氯酸)，冰水浴10min后将试管中的反应液进行离心，取上清液用去离子水稀释250倍，测定其260nm处的吸光值。

44、进一步地，所述底物rna与所述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1的质量比为5:1。

45、进一步地，所述用途包括如下步骤：取1ml的5％rna于试管中，再向试管中加入1ml0.2mol/l、ph 5.0的醋酸缓冲液进行混合，然后将试管水浴加热到70℃并水浴维持10min，加入10mg所述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1，继续反应15min，反应结束后加入等体积核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵和2.5％过氯酸)，冰水浴10min后将试管中的反应液进行离心，取上清液用去离子水稀释250倍，测定其260nm处的吸光值。

46、进一步地，所述聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1的用途是催化水解核酸然后生成5'-核苷酸。所述核酸沉淀剂是用来终止水解反应的作用，这样可以保证底物存在且催化反应进行的情况下，计算这段时间的酶活。

47、本发明的有益效果在于：

48、1、本发明提供的一种聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1的多级结构的制备方法，本发明通过静电作用固定化酶，可以最大程度的保留酶的活性，再通过聚合物包覆的方法，弥补稳定性的不足，达到活性和稳定性兼顾的目的。本发明不需要使用表面改性剂和交联剂等，避免其对酶活的影响。

49、2、本发明的核酸酶的负载量可高达3.35g核酸酶/g水滑石。

50、3、本发明提供的一种聚合物包覆水滑石固定化核酸酶p1用于催化核酸的水解反应生产核苷酸，酶活回收率可达70％，且稳定可以重复使用。