一种重组嵌合蛋白AQP4loops-DAPRin及其制备方法与应用

本发明属于生物医药工程，具体地，涉及一种重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的设计、制备方法及应用。

背景技术：

1、视神经脊髓炎谱系疾病是一种以视神经和脊髓受累为主的中枢神经系统性自身免疫性疾病，在临床上表现为不同程度的视力障碍及双下肢瘫痪。视神经脊髓炎谱系疾病的治愈率非常低，但是复发率很高，约60％视神经脊髓炎谱系疾病患者在症状出现的第一年内复发，超过90％的患者在三年内复发，多次复发会导致瘫痪。据统计，超过三分之一的视神经脊髓炎谱系疾病患者处于长期失业状态，部分患者日常生活无法自理，给社会和家庭带来了沉重的负担。

2、抗水通道蛋白4(aqp4)抗体是导致视神经脊髓炎谱系疾病的主要自身抗体。抗aqp4抗体在血脑屏障通透性较高的部位可通过屏障，与中枢神经系统星形胶质细胞足突上的水通道蛋白4结合后激活补体级联反应，引发炎性脱髓鞘，造成星形胶质细胞病变。目前，抗aqp4抗体已被定义为视神经脊髓炎谱系疾病临床诊断的特异性生物标记物。超过80％的视神经脊髓炎谱系疾病患者在血清学诊断时表现为抗aqp4抗体阳性，患者的病情严重程度与抗aqp4抗体水平高低密切相关。视神经脊髓炎谱系疾病的复发通常与可检测的抗aqp4抗体的复发有关，并且抗aqp4抗体阳性患者比阴性患者的复发风险高。因此，抗aqp4抗体的检测可作为医生判断患者复发风险高低及预后的依据。

3、目前，抗aqp4抗体的检测方法有基于组织的(间接免疫荧光)，基于细胞的(免疫细胞成像及流式细胞术)和基于蛋白质的(酶联免疫吸附及蛋白质印记)方法。最常用的检测方法是基于细胞的，但这种方法需要人工构建稳转细胞株，存在费时费力等缺点，很难在临床上实现大规模应用。基于蛋白质的酶联免疫吸附测定(elisa)法由于其灵敏度高于其余几种检测方法、易于使用、可以大规模分析受到临床医生的青睐。但是目前基于蛋白质的elisa检测法的准确性受到所使用蛋白质aqp4的限制。

4、目前视神经脊髓炎谱系疾病最常用的治疗方法有激素治疗、血浆置换及免疫吸附。由于激素治疗和血浆置换的疗效有限、副作用较大，现有的免疫吸附剂不能特异性去除致病性的抗aqp4抗体，因此改进aqp4用于临床诊断或以其制备特异性的免疫吸附剂将有助于对患者的治疗。

5、可特异性识别抗aqp4抗体的蛋白目前只有水通道蛋白4(aqp4)，aqp4是一种膜蛋白，是灵长类和啮齿动物大脑中发现的最丰富的水通道蛋白，在人体中主要分布在中枢神经系统中的星形胶质细胞足突上。aqp4以四聚体组装在细胞膜上，每个单体都具有独立的运转水通道活性。每个单体的相对分子质量约为30 000，含有301个氨基酸，其中大约有87％的氨基酸参与形成了6个疏水性跨膜螺旋结构，剩下的氨基酸形成5个环形结构(环a、b、c、d、e)，羧基、氨基末端和环b、d均在胞内，只有环a、c、e位于胞膜外侧并于2015年被鉴定为aqp4的主要抗原表位。但aqp4是膜蛋白，具有活性的aqp4的制备和保存是非常有难度的，跨膜螺旋结构的疏水性是aqp4蛋白制备困难的主要原因。使用最常规的去垢剂溶解细胞膜方法制备aqp4可能会破坏其天然构象，从而影响aqp4的特异性，进而影响基于蛋白质aqp4检测方法的准确性。现有技术的解决方案是，2018年祖向阳等人通过将环a、c、e嵌合到人抗体igg1恒定区ch2蛋白表面制备嵌合蛋白来改进aqp4：利用抗体蛋白的恒定区做支架制备重组嵌合蛋白来改良aqp4跨膜螺旋结构的疏水性(cn109053902a)。但该技术的问题是，制备的重组嵌合蛋白结构稳定性和可溶表达量低，使用重组嵌合蛋白制备的检测试剂尚未上市。

技术实现思路

1、本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，其目的在于，提供一种结构稳定的、可溶表达量高的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin，该蛋白是在骨架蛋白-预设计锚蛋白重复蛋白(daprin)表面展示aqp4抗原表位；

2、目的二在于提供制备上述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的方法；

3、目的三进一步提供上述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的应用，作为包被抗原用于抗aqp4抗体检测，可用于视神经脊髓炎谱系疾病的临床诊断。

4、目的四进一步提供上述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的应用，作为配基制备特异性免疫吸附剂，可用于视神经脊髓炎谱系疾病患者的血液净化治疗。

5、本发明是通过以下技术方案实现的：

6、本发明第一方面：

7、为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

8、一种重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin，所述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin是在骨架蛋白-预设计锚蛋白重复蛋白(daprin)表面展示aqp4抗原表位；所述骨架蛋白daprin由3部分：n端帽子、ar模块和c端帽子构成。每个ar模块都包含33个氨基酸残基，其中27个保守氨基酸形成α螺旋与n端、c端帽子一起构成了维持稳定的骨架结构，6个暴露于表面的氨基酸构成了可变区，可以耐受多个氨基酸插入、缺失和替换；所述骨架蛋白daprin与抗体类骨架蛋白不同，其骨架结构由α螺旋构成，稳定性更好，结构中不含有二硫键，更易在原核生物胞内环境维持结构稳定并大量表达；所述aqp4抗原表位包括环a、c、e；所述环a、c、e分别替换daprin的ar模块中的可变氨基酸使得环a、c、e展示在daprin骨架结构的上表面。

9、进一步的，编码aqp4抗原表位环a的氨基酸序列为seq id no：1；编码aqp4抗原表位环c的氨基酸序列为seq id no：2；编码aqp4抗原表位环e的氨基酸序列为seq id no：3；编码骨架蛋白daprin的氨基酸序列为seq id no：4。

10、进一步的，所述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的氨基酸序列为seq id no：5。

11、更进一步的，编码所述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的基因序列为seq id no：6。

12、本发明第二方面：

13、一种重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的制备方法，包括以下步骤：

14、(1)通过pcr扩增重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin的基因序列，经过双酶切处理后，使用片段回收试剂盒回收带有粘性末端的aqp4loops-daprin基因片段；

15、(2)通过双酶切处理原核表达载体，使用片段回收试剂盒回收带有粘性末端的载体片段；

16、(3)通过t4连接酶连接带有粘性末端的aqp4loops-daprin基因片段与带有粘性末端的载体片段，获得aqp4loops-daprin-pet重组质粒；

17、(4)通过化学转化法将aqp4loops-daprin-pet重组质粒导入表达菌株中，诱导剂诱导表达重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin；

18、(5)采用亲和层析分离纯化得到重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin。

19、本发明第三方面：

20、一种上述第一方面所述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin或上述第二方面所述制备方法制备的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin在抗aqp4抗体检测中的应用，所述应用进一步是指使用重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin制备抗aqp4抗体检测试剂在辅助视神经脊髓炎谱系疾病临床诊断中的应用。

21、进一步的，所述的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin检测抗aqp4抗体的方法包括：

22、(1)在微孔板中包被纯化得到的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin；

23、(2)对微孔板进行封闭处理，清洗后，加入患者血清；

24、(3)随后加入hrp标记的兔抗人二抗进行孵育；

25、(4)最后依次加入显色液和终止液，使用酶标仪测定吸光值。

26、本发明第四方面：

27、一种上述第一方面所述重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin或上述第二方面所述制备方法制备的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin在抗aqp4抗体去除中的应用，所述应用进一步是指重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin作为特异性免疫吸附剂在视神经脊髓炎谱系疾病治疗中的应用。

28、进一步的，所述的特异性免疫吸附剂的制备方法包括：

29、(1)清洗琼脂糖凝胶微球后将其置于合适大小的锥形瓶中，加入反应液后在摇床中37℃下进行双环氧活化反应，反应时间为1-3小时；所述反应液包括氢氧化钠和1,4-丁二醇缩水甘油醚；

30、(2)反应结束后，使用丙酮溶液对双环氧活化后的琼脂糖凝胶微球进行清洗，最后使用大量的双蒸水对其进行充分洗脱；

31、(3)使用固载缓冲液对吸附剂配基aqp4loops-daprin进行稀释，使用固载缓冲液冲洗平衡双环氧活化的琼脂糖凝胶微球，然后将琼脂糖凝胶微球与吸附剂配基aqp4loops-daprin按1：1～1：5的胶水比进行混合，置于水平翻转混匀仪上，室温下过夜反应进行固载；

32、(4)随后将固载有aqp4loops-daprin的琼脂糖凝胶微球与4％～6％的乙醇胺(ph8.5)溶液混合，室温下反应4h封闭剩余环氧基团。随后将溶液置换成为含有终浓度为0.02％叠氮钠作为保护剂的pbs溶液(1：1加入)，置于4℃保藏以待后续使用。

33、进一步的，所述的特异性免疫吸附剂的体外吸附测定：

34、本发明的免疫吸附剂可用于吸附兔抗aqp4抗体、健康人血浆中添加的兔抗aqp4抗体及视神经脊髓炎谱系疾病患者血浆中的抗aqp4抗体。在示例性实施方案中使用的兔抗aqp4抗体购买自北京博奥森生物技术有限公司。使用本发明的免疫吸附剂可以有效清除抗aqp4抗体，从而用于视神经脊髓炎谱系疾病患者的血液净化治疗。

35、本发明的免疫吸附剂的体外吸附测定的具体步骤包括：

36、(1)使用pbs溶液将购买的兔抗aqp4抗体稀释到合适的浓度后与上述本发明的免疫吸附剂混合，低温孵育，通过bca试剂盒测定上清液中兔抗aqp4抗体的浓度变化来测定抗体吸附情况；

37、(2)通过离心获得健康人的血浆样本，使用pbs溶液对血浆样本进行稀释，将适量的兔抗aqp4抗体添加到稀释后的健康人血浆样本中，与本发明的免疫吸附剂混合，低温孵育后使用再生缓冲液进行洗脱；

38、(3)通过离心获得视神经脊髓炎谱系疾病患者的血浆样本，使用pbs溶液进行稀释后与本发明的免疫吸附剂混合，低温孵育后通过elisa方法测定免疫吸附前后视神经脊髓炎谱系疾病患者血浆样本中抗aqp4抗体浓度的变化。

39、本发明的有益效果：本发明的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin能够同时展示aqp4的三个独立抗原表位。本发明所提供的重组嵌合蛋白制备方法实现了在原核表达系统中可溶表达膜蛋白的抗原表位，可溶表达量达到3.75mg/g菌体，具有成本低廉、操作简便、可溶表达量高的优势。本发明提供的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin作为包被抗原，可以特异性检测出视神经脊髓炎谱系疾病患者血浆中的抗aqp4抗体，检测下限为7ng/l。本发明提供的重组嵌合蛋白aqp4loops-daprin作为配基制备免疫吸附剂可以特异性去除视神经脊髓炎谱系疾病患者血浆中的抗aqp4抗体，去除率达到91.66±1.31％。