实时荧光PCR鉴定印度紫檀的方法、引物及试剂盒与流程

本发明属于木材检测鉴定，具体为利用实时荧光pcr鉴定印度紫檀的方法、引物及试剂盒。

背景技术：

1、印度紫檀(pterocarpusindicuswilld.)隶属于豆科紫檀属(pterocarpus)，列入国家标准gb/t18107-2017中，是一种紫檀属花梨木类树木。主要产地是印度、缅甸、菲律宾、马来西亚及印度尼西亚等国家，是一种珍贵红木，广泛用于高端家具、装饰地板、乐器、美术工艺品等的生产。由于其成材需要几十上百年的时间，加之自身材质耐用，能散发一定的香气，具有很高的市场价值和使用价值。

2、市场所售印度紫檀常常会出现掺假现象，而且出于监管针对印度紫檀的非法采伐、砍伐和木材贸易的需要，也需要对木材进行真伪鉴别。

3、目前，珍贵红木鉴别的方法，依赖于对木材的宏观和微观观察，主要是基于人工经验的传统植物学分类法即生物学显微结构检索表和计算机图像处理法，以及基于木材表面的光泽度、色度等物理指标的表观形态人工判别法，这些方法不仅费时费力，结果也具有主观不确定因素，难免出现误判。

4、目前也有报道通过dna识别技术检测包括标准基因及分子鉴定法和基因芯片法鉴定印度紫檀的方法，这些基于dna的检测技术，都首先要保证，必须提取出可用的印度紫檀dna，具有足够数量和质量的dna，但是印度紫檀主要是指心材，多年生的树木其近中心部分的木材，不含生活细胞，其贮藏物质已不存在或转化为心材物质，因此，从干燥的、老化的木材心材中提取dna是非常困难的，心材中只含有很少的片段dna，以及许多阻碍序列扩增的酚类化合物。在实际检测应用中，很难从待测木材中提取到可供检测的材料，难以有效鉴定印度紫檀。

5、并且，现有技术对印度紫檀的dna的各种鉴定方法，缺少特异性，难以简单快速准确的鉴别真伪。

技术实现思路

1、本发明的技术目的是，提供实时荧光pcr鉴定印度紫檀的方法、引物及试剂盒，采用本发明的特异性引物组合，建立荧光实时pcr检测方法，可以特异性的和高灵敏度的鉴定印度紫檀。并且提供一种改良ctab提取法，可以从干式心材样本中获得可扩增的dna，用于荧光实时pcr检测。

2、本发明采用的技术方案是：

3、实时荧光pcr鉴定印度紫檀的特异性引物组合，包括上游引物p9-f、下游引物和探针p9-p，序列如下：

4、上游引物p9-f：cggtcggaccagtccaatt

5、下游引物p9-r：ggttttggccacattcgatt

6、探针p9-p：fam-ctggaccctaggtcgattcggcct-tamra

7、其中fam为荧光报告基团，tamra为荧光淬灭基团。

8、本发明还提供实时荧光pcr鉴定印度紫檀的试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物组合。

9、进一步，所述试剂盒包括pcr扩增反应液，所述pcr扩增反应液包括上游引物p9-f、下游引物p9-r、探针p9-p、pcr缓冲液、脱氧酸核苷三磷混合物(dntp)和dna聚合酶。

10、优选pcr扩增反应液中，上游引物p9-f的浓度为0.5μm；

11、优选pcr扩增反应液中，下游引物p9-r的浓度为0.5μm；

12、优选pcr扩增反应液中，探针p9-p的浓度为0.5μm。

13、进一步，更优选所述pcr扩增反应液为20μl，包括以下组分：probeqpcr mastermix(英国赛默飞世尔科技)10μl；0.5μm上游引物p9-f，0.5μm下游引物p9-r，0.5μm探针p9-p，dna模板4.0μl；补水至20μl。

14、更优选所述pcr扩增反应液为20μl，组成为：probeqpcrmastermix(英国赛默飞世尔科技)10μl；浓度都为10μm的上游引物p9-f和下游引物p9-r各1μl；浓度10μmol/l的探针p9-p1μl；dna模板4.0μl；补水至20μl。

15、所述试剂盒还可以包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为印度紫檀全基因提取物，阴性对照为灭菌蒸馏水。

16、本发明还提供所述实时荧光pcr鉴定印度紫檀的试剂盒在检测鉴定印度紫檀中的应用。

17、进一步，本发明提供一种利用实时荧光pcr鉴定印度紫檀的试剂盒实时荧光pcr鉴定印度紫檀的方法，所述方法包括以下步骤：

18、(a)提取待测木材样品的dna作为pcr模板；

19、(b)以提取的dna为模板，根据所述试剂盒组分，配制pcr扩增反应液，进行实时荧光pcr检测，根据检测到的荧光信号进行结果分析，判断样品是否为印度紫檀。

20、进一步，所述步骤(b)中，pcr扩增反应液为20μl，包括以下组分：probeqpcrmastermix(英国赛默飞世尔科技)10μl；0.5μm上游引物p9-f，0.5μm下游引物p9-r，0.5μm探针p9-p，dna模板4.0μl；补水至20μl；

21、实时荧光pcr检测的反应程序为：50℃加热2min；95℃孵育10min；95℃变性15s，60℃退火1min，运行40个循环；

22、所述步骤(b)中，所述结果分析方法为：于60℃处采集荧光进行荧光检测，ct值小于或等于36，则判断为阳性，即样本为印度紫檀；ct值大于40，则判断为阴性，即样本不是印度紫檀；若ct值在36-40之间，调整模板浓度，重做实时荧光pcr；再次扩增后ct值仍小于40，则判定为阳性；再次扩增后，ct值大于或等于40，则判断为阴性；

23、进一步，荧光检测模式选择fam荧光，基线和阈值设定：基线调整取3～15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照(h2o)检测荧光曲线的最高点，若待测样品荧光增长曲线高度超过阈值，并呈良好的对数增长，ct值小于或等于36，则判断为阳性，即样本为印度紫檀；若ct值在36-40之间，应调整模板浓度，重做实时荧光pcr。再次扩增后ct值仍小于40，则判定为阳性。再次扩增后，ct值大于或等于40，则判断为阴性；

24、进一步，所述步骤(b)中，优选每次试验均设阴性对照和阳性对照，若阴性对照结果ct值小于或等于36.0，或者是阳性对照结果ct值大于36.0或扩增曲线低于基线，则判断为检测失效。

25、进一步，所述步骤(1)提取待测木材样品的dna作为pcr模板，优选按以下步骤进行：

26、(1)称取8g研磨好的木材粉末，加入40ml的ctab提取液，65℃温浴3h，期间震荡混匀4-5次；

27、(2)离心，取上清液a；

28、(3)上清液a加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇的体积比为24：1，充分振荡混匀，静置后离心，取上清液b；

29、(7)上清液b加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃沉淀4～5h；

30、(8)离心，弃上清，得沉淀c；

31、(9)所得沉淀c用体积分数75％乙醇洗涤1次，离心后弃上清，得沉淀d；

32、(10)沉淀d自然干燥后，用100μl去离子水或te缓冲液溶解沉淀；

33、(11)核酸溶液用tanbeadplantdnaautokit核酸提取试剂盒纯化，得到总dna作为模板，置于-20℃保存。

34、本发明采用改良的ctab法从干式心材样品中提取的dna的数量和质量分别为2.40-37.70ng/μl，od260/280值为1.55-2.12。本发明经过筛选得到p9引物组合，可以扩增印度紫檀的特异性微卫星pin2-20序列，经分析表明，实时荧光定量pcr鉴定印度紫檀，特异性好，可特异性的扩增目标印度紫檀样品，得到典型扩增曲线，对其他相似的木材物种样品不扩增，提高了现有技术对印度紫檀鉴定方法的准确度。本发明方法的灵敏度高，检测限在0.17ng/μl左右。因此，本发明可实现对印度紫檀进行快速、准确、特异检测。本发明方法有助于木材心材dna的提取和木材原木的物种鉴定，可用于法医鉴定、进出口检测和自然资源保护领域等。