拟鬼伞来源的非特异性过氧合酶突变体及其制备和应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种拟鬼伞来源的非特异性过氧合酶突变体，其制备方法，以及其作为生物催化剂在化合物c＝c键环氧化反应中的应用，尤其是单萜类化合物柠檬烯的c1＝c2键环氧化反应。

背景技术：

1、柠檬烯广泛存在于柑橘类水果中，对其有效开发利用是近年来的研究热点，其中将其转化生成柠檬烯-1,2-环氧化物产物是提高其附加值方向之一。柠檬烯-1,2-环氧化物的分子结构中存在着十分活泼的环氧基团，具有非常活跃的反应特性和优良的物理特性，可以通过与多种亲核试剂的开环反应衍生获得一系列重要的有机化合物，因此在有机合成上是非常有用的中间体。其衍生化合物可广泛用于医药、香精香料等，如可与二氧化碳共聚而制备得到生物基聚碳酸酯，有望替代传统的石油基。

2、为获得柠檬烯-1,2-环氧化物的高收率，国内外对其合成方法进行了大量的研究。如应用金属络合物作为均相催化剂，催化柠檬烯环氧化反应柠檬烯-1,2-环氧化物，但催化剂价格昂贵，且难以分离和再利用，限制了其进一步发展。也有报道使用双氧水或叔丁基过氧化氢作为非均相固体催化剂发生柠檬烯环氧化反应。由于柠檬烯存在两个双键，在环氧化反应过程中氧对双键的亲电进攻下，除了1、2位的烯烃外，8、9位上的烯烃也会发生环氧化，造成柠檬烯环氧化的选择性很难控制；其次，由于柠檬烯有两个对位取代基，在立体空间位阻效应下，柠檬烯1、2位烯烃的环氧化难度更大；另外，在柠檬烯的催化氧化过程中，有烯醇氧化和环氧化两个不同机理的竞争过程，使柠檬烯环氧化更困难，以上因素造成柠檬烯-1,2-环氧化物的合成收率低，具有较大的挑战性。因此，针对以柠檬烯为底物，提高柠檬烯-1,2-环氧化物生成反应的立体选择性及催化活性具有非常重要的现实意义。

3、非特异性过氧合酶(unspecific peroxygenases,upos)是一类来源于真菌的氧化酶，属于血红素氧化酶家族，具有多功能氧化催化活性。与目前研究报道较多的油酸水合酶和p450单加氧等氧化酶相比，upos的底物范围更广，且催化过程可以直接利用过氧化氢(h2o2)作为氧供体和电子受体，无需复杂的电子传递链等，因而具有更高的实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明提供了一种来源于拟鬼伞(coprinopsismarcescibilis)的非特异性过氧合酶突变体，该突变体具有较高的活力与立体催化专一选择性，能够选择性的催化柠檬烯c1＝c2键环氧化反应，相对于野生酶，该突变体能够显著提高催化效率和产物得率，减少副产物，降低生产成本。

2、本发明的技术方案具体如下：

3、本发明首先提供了一种来源于拟鬼伞的非特异性过氧合酶突变体，该突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，并将其命名为tcmaupo。

4、对于tcmaupo，其氨基酸序列相对于野生酶(即cmaupo)序列，存在3个突变位点，分别为：

5、第125位氨基酸由t突变为a；

6、第172位氨基酸由s突变为a；

7、第129位氨基酸由a突变为g。

8、与tcmaupo相关的生物材料也在本发明的保护范围内，所述生物材料包括：

9、a1).编码tcmaupo的基因；

10、a2).包含a1)所述基因的重组载体；

11、a3).包含a1)所述基因或a2)所述重组载体的转化体。

12、在上述生物材料中，所述基因的核苷酸序列可以如seq id no.1所示；该基因序列是以拟鬼伞的碱基序列为母本进行三点突变(即t125a-s172a-a129g)设计得到。

13、在上述生物材料中，所述重组载体的基础表达载体可以为pet-23a或pet-28a，优选pet-23a；具体可通过本领域常规方法将编码tcmaupo的基因与基础表达载体连接构建而成。

14、在本发明的一个实施例中，重组载体通过以下方法制备：将通过人工化学合成所得的核酸产物(即tcmaupo基因片段)与表达载体pet-23a分别用限制性内切酶ecor i和noti双酶切，形成互补的粘性末端，再经过t4连接酶连接，即可形成重组载体pet-23a-tcmaupo。

15、在上述生物材料中，所述转化体为重组工程菌，且宿主细胞优选但不限于大肠杆菌bl21(de3)菌株；具体可通过将上述重组载体或编码tcmaupo的基因转化至宿主细胞中制得，所述宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，但要能满足重组载体稳定的自行复制，且携带的编码tcmaupo的基因可被有效表达。

16、在本发明的一个实施例中，将重组载体pet-23a-tcmaupo转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，获得了基因工程菌株(即转化体)，并将该基因工程菌株命名为：e.colibl21(de3)/pet-23a-tcmaupo。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热激法等，上述实施例中采用的是电转法，且电转条件为：0.2cm宽转化杯，电压1.5kv，时间6s。

17、利用上述生物材料，本发明进一步提供了制备tcmaupo的方法，包括以下步骤：

18、s1、人工合成编码tcmaupo的基因片段；

19、s2、将编码tcmaupo的基因片段与表达载体连接，构建得到重组载体；

20、s3、将重组载体转化至宿主细胞得到转化体；

21、s4、对转化体诱导培养，从培养物中获得重组非特异性过氧合酶(即tcmaupo)。

22、在上述方法中，当转化体为大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet-23a-tcmaupo时，s4步骤采用的培养基优选lb培养基，发酵方式优选采用摇瓶培养发酵，具体为：将e.colibl21(de3)/pet-23a-tcmaupo接种至含氨苄青霉素的lb培养基中培养，当培养液的光密度od600达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mm(优选0.2mm)的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度15～20℃(优选18℃)，即可高效表达重组非特异性过氧合酶。

23、本发明提供的tcmaupo在化合物c＝c键环氧化反应中具有优异的转化率和立体催化专一选择性，故其能够作为生物催化剂在化合物c＝c键环氧化反应的应用。

24、在上述应用中，生物催化剂的形式可以为以下任一种：

25、b1)细胞，所述细胞中含有重组载体，且重组载体含有编码tcmaupo的基因；

26、b2)粗酶液，由b1)所述细胞发酵所得的发酵液；

27、b3)纯酶液，由b2)所述粗酶液进行提纯后所得；

28、b4)酶粉，由b2)所述粗酶液或b3)所述纯酶液干燥所得，且酶粉中的tcmaupo仍保留有催化活性；

29、b5)固定化酶，即将tcmaupo通过物理或化学方法处理，在保留其催化活性的同时，使其稳定性增加，可反复多次使用。

30、在上述应用中，化合物为单萜类化合物柠檬烯，且催化反应具体发生在c1＝c2位。

31、进一步地，tcmaupo催化柠檬烯c1＝c2环氧化反应的条件为：磷酸盐缓冲溶液中，在柠檬烯、羟丙基β环糊精与h2o2的存在下，加入tcmaupo催化柠檬烯c1、c2位的c＝c键发生环氧化反应，生成柠檬烯-1α,2α-环氧化物。

32、更进一步地，在上述催化反应中，较佳的tcmaupo用量为0.5～3μm，羟丙基β环糊精浓度为5％，柠檬烯浓度为10mm～50mm，h2o2浓度为0.5～2mm，反应温度为30～40℃，磷酸缓冲液的ph为6.5～8.0，反应在220～400rpm振荡的条件下进行。反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间为标准。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

33、本发明的有益效果为：

34、本发明提供的非特异性过氧合酶突变体具有立体催化专一选择性，能够高选择性地催化柠檬烯c1＝c2键环氧化反应，即只在c1、c2位的c＝c键发生环氧化反应，没有其他副产物，产物(即柠檬烯-1,2-环氧化物)纯度高，分离工艺简单，且具有反应条件温和，操作简便等优势，有效解决了从拟鬼伞直接获取的cmaupo对柠檬烯c＝c键环氧化反应选择性差、副产物多的问题。

35、本发明还提供了与非特异性过氧合酶突变体相关的基因、表达载体、转化体等生物材料，并构建了重组表达制备非特异性过氧合酶突变体的方法，为非特异性过氧合酶突变体的生产、应用奠定了基础。