一种多酶偶联一锅法不对称制备精草铵膦的方法

本发明属于生物，尤其涉及一种利用生物多酶偶联一锅法不对称制备精草铵膦的方法。

背景技术：

1、草铵膦铵盐(简称ppt)化学名为2-氨基-4-(羟甲基膦基)丁酸，是1986年由德国赫斯特公司开发的一种光谱的非选择性氨基酸类除草剂，具有除草活性高、杀草迅速、作用杂草谱广、有效施用量小、在土壤中易降解、对周边环境影响小等优点。是目前用量仅次于草甘膦的世界第二大转基因作物耐受除草剂，且由于抗草甘膦杂草的蔓延以及百草枯、敌草快等除草剂的限用，草铵膦的市场需求量快速增加，且有望在未来5年内超过草甘膦市场。但由于商业化应用的草铵膦除草剂通常由d，l-草铵膦的外消旋混合物组成，其中仅l-草铵膦(质量分数约40-60％)具有除草活性，另一半的d-草铵膦降低了农药的原子利用率，且造成了土壤板结，不利于环境保护。因此通过将d-草铵膦转化为l-草铵膦，能够减少草铵膦原药一半的用量，这对于降低成本，提高原子经济性以及减轻环境压力具有重要意义。

2、目前l-草铵膦的制备方法主要包括化学法和生物法。但化学法普遍存在步骤繁琐、产品光学纯度偏低、生产成本偏高，安全性较差以及环境污染严重等缺点。目前精草铵膦(l-草铵膦)生产厂家普遍都趋于采用生物催化转化法。生物催化法生产精草铵膦具有步骤简单、反应条件温和、立体选择性高、产品收率高等优点，是工业化制备l-草铵膦的重要趋势，且受到国家政策的大力支持。生物法制备精草铵膦主要包括酶法合成法和酶法拆分法两类：

3、(1)酶法合成法主要以l-草铵膦的衍生物(如n-苯乙酰-d,l-草铵膦或草铵膦腈胺)为底物，通过腈水解酶等直接水解获得l-草铵膦，主要优点是转化率高，产物e.e.值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。

4、(2)酶法拆分法利用外消旋的d,l-草铵膦(d,l-ppt)为底物，通过两步酶法进行选择性拆分，将d-草铵膦(d-ppt)通过d-氨基酸氧化酶(daao)转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)，并进一步通过l-谷氨酸脱氢酶还原为l-草铵膦(l-ppt)，同时保留原有质量分数为40-60％的l-草铵膦。该法具有原料简单易得、工艺简单、成本较低以及绿色环保等优势，具有较高的工业化应用价值。但由于d-氨基酸氧化酶对非天然底物d-草铵膦的催化活力较低，且l-谷氨酸脱氢酶催化的还原反应需要添加化学计量的还原型辅酶nad(p)h，造成成本的浪费，阻碍了其工业化应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种多酶偶联一锅法不对称制备精草铵膦的方法，使用该方法制备l-草铵膦，具有底物转化率高、产品光学纯度高、产物易于分离提纯以及反应进程显著缩短等优势。

2、为实现上述目的，本发明提出的具体技术方案为：

3、一种多酶偶联一锅法不对称制备精草铵膦的方法，在同一体系中同时加入d-氨基酸氧化酶，l-谷氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶，利用它们的催化作用，将外消旋型d,l-草铵膦中的d-草铵膦完全转化为l-草铵膦，同时保留原药中的l-草铵膦。

4、所述的方法，d-氨基酸氧化酶催化底物d-ppt转化生成中间产物ppo；l-谷氨酸脱氢酶用于将ppo氨化还原为l-草铵膦；甲酸脱氢酶用于还原型辅酶nadh或nadph的循环再生。

5、所述的方法，所用d-氨基酸氧化酶，l-谷氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶的添加形式分别选自酶的粗细胞提取物、纯化酶液、固定化酶、含有酶的冻干细胞或发酵液中的至少一种。

6、所述的方法，表达d-氨基酸氧化酶，l-谷氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶的宿主细胞分别选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或大肠杆菌(escherichia coli)中的至少一种。

7、所述的方法，以湿菌体重量计，所述重组微生物的添加量为1-200g湿菌体/l反应液。

8、所述的方法，所述酶催化转化反应在ph为7-10的反应液体系中进行；反应温度为25-45℃，时间为不少于6h。

9、所述的方法，反应体系中还需要添加过氧化氢酶和无机氨基供体，优选为硫酸铵或甲酸铵中的至少一种。

10、所述的方法，反应体系内各物质的初始浓度为：d,l-ppt300～500mm，无机氨基供体300～500mm，过氧化氢酶3000-8000u/ml。

11、所述的方法，反应体系加入氨水控制ph后反应。

12、所述的方法，外消旋型d,l-草铵膦中的d-草铵膦所占质量分数为40％-60％。

13、本发明一种多酶偶联一锅法不对称制备精草铵膦的方法，其详细步骤包括：(1)在d-氨基酸氧化酶的存在下，使外消旋型d,l-草铵膦中质量分数约为40-60％的d-ppt氧化转化为中间体ppo，同时使用过氧化氢酶将副产物过氧化氢分解，以放止副产物积累对酶蛋白的毒害作用；(2)在l-谷氨酸脱氢酶和无机氨基供体的存在下，使中间体ppo氨化还原为l-ppt，同时构建辅酶循环系统，在甲酸脱氢酶的存在下，使反应中消耗的还原型辅酶nad(p)h再生，降低成本，缩短反应进程。在整个反应过程中，草铵膦原药中的d-ppt能够完全转化为l-ppt，同时保留了原料中质量分数为40-60％的l-ppt，添加的无机氨基供体以及还原型辅酶的量保持在较低水平，极大程度降低了反应成本。

14、d-氨基酸氧化酶(d-aminoacidoxidase,daao,ec 1.4.3.3)属于氧化还原酶类，能够以绝对的立体特异性将d-氨基酸cα上的氨基氧化为羰基，同时产生副产物过氧化氢。其催化机制主要包括还原半反应和氧化半反应：d-氨基酸的氢化物当量首先转移到fad的异四氧嘧啶部分，生成中间体亚氨基酸，然后自发水解成相应的α-酮酸和nh4+，随后，还原型fadh2通常在产物亚氨基酸离解之前被o2重新氧化生成过氧化氢(h2o2)。

15、本技术所述d-氨基酸氧化酶是指具有催化底物d-ppt转化生成中间产物ppo活性的酶。d-氨基酸氧化酶可以为本领域已知的任何具有d-氨基酸氧化酶活性的酶。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶来源于可变三角酵母(trigonopsis variabilis)，细红酵母(rhodotorulagracilis)，假丝酵母(candida parapsilosis)，尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和猪肾(pig kidney)的d-氨基酸氧化酶，其ncbi登录号依次为caa90322.1，aab51107.1，kai5911410.1，exk46480和p00371.2。优选地，所述d-氨基酸氧化酶为来自于细红酵母(rhodotorulagracilis)的1c0k。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶的核苷酸序列与seq id no.2所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列为seq id no.1。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶的核苷酸序列为seqid no.2。

16、l-谷氨酸脱氢酶(l-glutamatedehydrogenase,gludh,ec:1.4.1.2)属于辅酶nad(p)h依赖型氧化还原酶，其能够在辅酶nad(p)h和无机氨基供体的存在下催化前体物质酮酸生成对应的l-型氨基酸。同时也能够在nad(p)+的存在下催化反向反应的发生。

17、本技术所述的l-谷氨酸脱氢酶是指具有催化精草铵膦中间产物ppo转化生成终产物l-ppt活性的酶。l-谷氨酸脱氢酶可以为本领域已知的任何具有l-谷氨酸脱氢酶活性的酶。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶来源于共生梭菌(clostridium symbiosum)，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)，球形赖氨芽孢杆菌(lysinibacillussphaericus)和大肠杆菌(escherichia coli)的l-谷氨酸脱氢酶，其ncbi登录号依次为caa77805.1，wp_221249962.1，kww16710.1，kek10552.1和aaa87979.1。优选地，所述l-谷氨酸脱氢酶为来自于大肠杆菌(escherichia coli)的2yfh。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列与seq id no.3所示的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列与seq id no.4所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为seq id no.3。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列为seq id no.4。

18、本技术中所述辅酶循环系统是指利用甲酸脱氢酶进行ppo还原过程中还原型辅酶nad(p)h的循环再生。该方法不产生葡萄糖酸，有利于下游产物分离纯化。在一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶来源于大肠杆菌(escherichia coli)，路德维希肠杆菌(enterobacterludwigii)，白念珠菌(candida boidinii)，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和球形赖氨芽孢杆菌(lysinibacillussphaericus)的甲酸脱氢酶，其ncbi登录号依次为aaa23754.2，akm87309.1，cab54834.1，kaf1902530.1和kek12543.1。优选地，所述l-谷氨酸脱氢酶为来自于大肠杆菌(escherichia coli)的1aa6。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列与seq id no.5所示的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列与seq id no.6所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列为seq id no.5。在一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶的核苷酸序列为seq id no.6。

19、本技术所述d-氨基酸氧化酶，l-谷氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶的形式可以是酶的粗细胞提取物；纯化酶液；固定化酶；含有酶的冻干细胞、发酵液或其他任何合适的形式。

20、本技术所述产d-氨基酸氧化酶基因工程菌是以e.coli bl21(de3)为宿主，表达seq id no.1所示的d-氨基酸氧化酶。所述基因工程菌表达载体选自pet系列质粒载体，优选地，本技术所述基因工程菌的构建采用表达载体pet-30a(+)。其构建方法包括将seq idno.2所示地d-氨基酸氧化酶编码基因通过双酶切和t4连接酶连接至表达载体pet-30a(+)上，随后将该质粒载体通过电转化方法直接转化进入肠杆菌e.coli bl21(de3)中，经过筛选后获得正确的转化子e.coli bl21(de3)-pet-30a(+)-daao，即所述表达谷d-氨基酸氧化酶的基因工程菌。

21、本技术所述谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶由单一的重组基因工程菌共表达，所述基因工程菌是以e.coli bl21(de3)为宿主，表达seq id no.3所示l-谷氨酸脱氢酶和seq idno.5所示甲酸脱氢酶。

22、所述基因工程菌的质粒表达载体选自pet-duet-1，prsf-duet-1，pacyc-duet-1中的任意一种，优选地，本技术所述基因工程菌的构建采用表达载体pet-duet-1。所述基因工程菌的构建方法包括：将seq id no.4所示的l-谷氨酸脱氢酶编码基因连接至表达载体pet-duet-1的mcsⅰ上，将seq id no.6所示的甲酸脱氢酶编码基因序列连接至表达载体pet-duet-1的mcsii上。然后将连接有l-谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶编码基因的质粒载体通过电转化方法直接转化进入大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，经过筛选后获得正确的转化子e.coli bl21(de3)-pet-duet-1-gludh-fdh，即所述共表达谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的基因工程菌。

23、在一些实施方法中，本技术所涉及多酶偶联一锅法不对称制备精草铵膦的反应方法如下：向ph为7-10，含有外消旋型d,l-ppt、甲酸铵、过氧化氢酶的混合反应液体系中加入所述表达d-氨基酸氧化酶和共表达l-谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的基因工程菌经发酵获得的酶液或湿菌体细胞，在25-45℃温度条件下反应6-16h，获得l-草铵膦。

24、本技术所述过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢以防止过氧化氢的积累对酶催化剂造成的毒害作用。过氧化氢酶可以为本领域已知的任何具有过氧化氢酶活性的酶，例如购自上海源叶生物科技有限公司，商品编号为cas 9001-05-2的过氧化氢酶。

25、在一些实施方法中，本技术所述反应体系中添加的基因工程菌以湿菌体重量计，所述重组微生物的添加量为1-200g湿菌体/l反应液。

26、优选的，本技术反应方法中反应液体系内各物质的初始浓度可以为：d,l-ppt300～500mm，甲酸铵300～500mm，过氧化氢酶3000-8000u/ml。

27、本技术所述生产方法中产物l-ppt的产率可以通过本领域已知的任何方法测量。例如，可以通过手性hplc来测量所获得的草铵膦产物中两个构型含量。在一些实施方式中，获得的草铵膦产物的对映体过量(e.e.)至少为80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％。

28、本发明的有益效果主要体现在：

29、(1)直接以外消旋型d,l-ppt为底物进行拆分，底物中的d-ppt被d-氨基酸氧化酶完全氧化转化为中间产物ppo，并进一步被l-谷氨酸脱氢酶还原为l-ppt，底物转化率≥49.95％。同时原料中l-ppt得以保留，防止了原料浪费。

30、(2)采用一锅法进行精草铵膦的制备，氧化反应的中间产物可以在原位直接被还原为终产物l-ppt，而无需分别在两个步骤中进行底物d-ppt的氧化和ppo的还原，防止了中间产物的积累造成反应速率降低，加快了反应进程。与现有技术报道中多酶级联方法制备l-ppt相比(专利号cn 112410383 a)，本发明所述方法整个反应可以最快可以在16h内完成，同时使用的无机氨基供体价格更低，且在后续产物纯化分离中可轻易除去，大幅降低了生产成本。

31、(3)本技术所述多酶级联反应仅需添加少量的过氧化氢酶和辅酶nad(p)h，反应过程简单，反应条件温和，反应速度快，副产物co2不会影响后续产物分离，产物光学纯度高。相比于传统化学法制备l-ppt，该方法更加绿色、环保、低碳，适合大规模工业化生产应用。