儿茶素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的对照品的制备方法与流程

本发明涉及一种儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的制备方法，尤其涉及能够制备可以用于适用于工业化的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的固体对照品的制备方法。

背景技术：

1、儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(英文名：catechin 7-o-β-d-glucopyranoside)是一种口服活性天然产物，具有抗氧化和抗炎活性，并减轻线粒体功能障碍，研究表明其对链脲佐菌素诱导的细胞损伤显示出保护作用，能增加因链脲佐菌素治疗而减弱的mnsod水平，恢复链脲佐菌素诱导的线粒体cat水平降低，还有研究表明其能显示出对lps/d-galn诱导的致死性的轻度保护作用，可抑制tnbs诱导的结肠炎大鼠体重减轻和肠道炎症损伤。该化合物还因其很可能作为多种中药鉴定的特征成分而备受关注。其结构如下：

2、

3、由于具有众多的羟基，该化合物为植物中的亲水性成分，容易与各种鞣制、苷类成分混杂在一起。已经公开的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的现有提取制备方法非常有限，目前尚无高效的相关的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷工业化提取制备方法。国内有关学者从防城茶、大黄、蕨麻等植物中采用提取、萃取、mci、sephadex lh-20、中压c18、pre-hplc等步骤获得少量的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，制备工艺复杂，得率低和纯度不高，研发提供高通量、能提供高纯度、特别是高tlc的纯度儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，且适合大量制备的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷对照品制备方法是非常迫切的。

4、近年来，穆合塔尔·卡德尔哈孜首次报道了赤小豆中儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的存在，并提供了含量方法，但是并没有涉及如何大量提取分离该成分的方法。作为一种常见的中药资源，开发赤小豆作为儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷来源成为可能，然而赤小豆淀粉含量高、次生代谢成分所含化合物成分及其复杂，能否作为合适的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷来源并不明朗，是否能低成本的从赤小豆中获得儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷也极具挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高通量、能提供高纯度的纯度儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，且适合大量制备的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷对照品制备方法。本发明中，儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷有时也称为分离目标物。本发明对儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离纯化做了很大的改进和提升，使其适合于赤小豆化学成分的提取，经过深入摸索，采用成本可控的提取分离手段，实现可以工业化的目标化合物提纯方法，在化合物的量和纯度上有了很大的提高，从而完成了本发明。

2、如果并未特殊说明，本发明中目标物的纯度和含量的百分数，为以质量比计的含量。如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如甲酸在乙腈水溶液中的含量配比，以体积分数计量。

3、本发明通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。

4、本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：一种儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

5、大孔树脂富集工序，将赤小豆总提取物溶液上样于苯乙烯型非极性大孔吸附树脂柱层析，分别以水、5～15％的乙醇洗脱去除前杂、再用35％～45％的乙醇洗脱，收集35％～45％的乙醇洗脱液的流分，将该流分于65℃以下温度减压浓缩得到赤小豆粗提物i，

6、聚酰胺纯化工序，将赤小豆粗提物i上样于20～90目聚酰胺柱层析，分别以水洗脱2～6倍柱体积的前杂、再用5％～15％乙醇洗脱液洗脱2～6倍柱体积的前杂，利用25％～35％乙醇洗脱，收集25％～35％乙醇洗脱液，于65℃以下温度减压浓缩得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷粗提物i；

7、反相色谱纯化工序，将儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷粗提物上样至反相色谱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.1～1mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.15～0.2:1，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液在55℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的粗提物ii；

8、溶剂处理纯化工序，将反相色谱纯化工序中所得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的粗提物ii利用重结晶方法进行纯化，并重复进行2次以上重结晶，得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的对照品。

9、优选的是，所述赤小豆总提取物溶液的制备方法如下：将赤小豆粉碎，加入5～15倍重量的水中，于40～60℃提取3～6小时，冷却过滤，滤液加入0.5～1.2倍的乙醇静置后过滤，滤液于60℃下浓缩，得赤小豆总提取物溶液。其中，赤小豆总提物获取方法中，提取效率最高的是低温水提取、使用醇提取导致大量次生代谢产物被提出，相对于目标物而言杂质增多。优选55℃以下的水提取，这样可以有效防止难以过滤滤液。

10、在优选的事实方式中，聚酰胺纯化工序中，使用尼龙6或尼龙66结构的聚酰胺柱层析，分别以水洗脱3～4.5倍柱体积的前杂、再用8％～12％乙醇洗脱3～4倍柱体积的前杂，利用28％～32％乙醇洗脱，收集28％～32％乙醇洗脱液，于65℃以下温度减压浓缩得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷粗提物i。

11、在优选的事实方式中，纯化工序中，将反相色谱纯化工序中所得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的粗提物ii用乙醇溶解，再加入对于儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷而言为难溶性溶剂的溶剂，在50～60℃下将溶液进行浓缩，析出固体，抽滤，得到目标物的半成品固体粉末，所述难溶性溶剂选自石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、环己烷。

12、在本发明优选的实施方式中，纯化工序中，将反相色谱纯化工序中所得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的粗提物ii用乙醇溶解，于0～4℃结晶，过滤获得结晶，再进行2次以上重结晶，得到儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的对照品。

13、在本发明优选的实施方式中，其特征在于反相色谱纯化工序中，以压力为0.1～0.3mpa进行洗脱，采用乙腈和水的混合液进行洗脱，选用40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶填料。

14、在本发明优选的实施方式中，提取工艺中，在粉碎的赤小豆中，加入10～12倍重量的水，于50℃以下的温度提取4～5小时，冷却过滤，滤液加入等量的乙醇静置0.5至3小时后过滤，滤液于60℃下浓缩，得赤小豆总提取物溶液。

15、本发明还提供一种纯度为98.5％以上的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的固体对照品，其通过权利要求1的制备方法制备得到，本发明的方法制备的对照品hplc纯度高，成本优异。

16、本发明具有以下特点：

17、1、本发明操作简单高效，能够进行工艺放大，分离得到大量儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷单体；

18、2.拓展了目标化合物的来源为赤小豆，可以极大的降低来源成本；本发明针对赤小豆的成分进行了优化；

19、3.通过本发明优化后的具体实验方案能够分离得到hplc纯度大于98.5％的儿茶素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷单体。