本发明涉及生物,具体涉及一种b/austria/1359417/2021(b/victorialineage)ha抗原制备方法。
背景技术:
1、流行性感冒是由甲、乙、丙三型流感病毒分别引起的一种急性呼吸道疾病,属于丙类传染病。流感在中国以冬春季多见,临床表现以高热、乏力、头痛、咳嗽、全身肌肉酸痛等全身中毒症状为主,而呼吸道症状较轻。
2、流感病毒容易发生变异,传染性强,人群普遍易感,发病率高,历史上在全世界引起多次暴发性流行,是全球关注的重要公共卫生问题。因此,世界卫生组织(who)每年上、下半年会分别公布下一季的北半球和南半球流感疫苗组分。
3、who发布的2022-2023鸡胚培养流感病毒疫苗组分b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)毒株,研究其真核细胞分泌表达将助力疫苗相关研发或检测工作。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victorialineage)ha抗原(简称ha抗原)制备方法。
2、本发明发现人工信号肽(信号肽sp1,seq id no.1)可引导流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌至培养上清,经过镍柱亲和层析即可获得高纯度抗原,且其分泌表达产量显著高于ha蛋白天然信号肽(信号肽ha)和白蛋白信号肽(信号肽al)。
3、第一方面,本发明要求保护seq id no.1所示多肽(即为实施例中的sp1信号肽)或其相关生物材料在如下任一中的应用:
4、p1、提高流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原在宿主细胞中的分泌表达产量;
5、p2、提高流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原在宿主细胞中的分泌表达效率;
6、p3、制备流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌蛋白制品;
7、所述相关生物材料为seq id no.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
8、在本发明的具体实施方式中,所述重组载体为将seq id no.7所示dna片段(seqid no.7的第13-69位为信号肽sp1的编码基因,即seq id no.2)插入到pcgs3载体的多克隆位点(如hind iii和pac i)后得到的重组质粒。
9、进一步地,所述宿主细胞可为真核宿主细胞。如:hek293细胞,cho细胞,酵母细胞和昆虫细胞等。
10、在本发明的具体实施方式中,所述宿主细胞具体为expi293f细胞。
11、进一步地,所述seq id no.1所示多肽的编码基因可为如下任一:
12、(a1)seq id no.2所示的dna分子;
13、(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码seq id no.1所示多肽的dna分子;
14、(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码seq id no.1所示多肽的dna分子。
15、上述编码基因中,同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性,如ncbi主页网站的blast网页。例如,可在高级blast2.1中,通过使用blastp作为程序,将expect值设置为10,将所有filter设置为off,使用blosum62作为matrix,将gap existence cost,per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11,1和0.85(缺省值),检索一对核苷酸序列的同一性,进行计算,然后即可获得同一性的值(%)。
16、上述核酸分子或编码基因中,所述严格条件可为如下:50℃,在7%十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,2×ssc,0.1% sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,1×ssc,0.1%sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,0.5×ssc,0.1% sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,0.1×ssc,0.1% sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mmedta的混合溶液中杂交,在65℃,0.1×ssc,0.1% sds中漂洗;也可为:在6×ssc,0.5%sds的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1% sds和1×ssc,0.1% sds各洗膜一次。
17、在p2中,所述流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原在宿主细胞中的分泌表达效率是指:在宿主细胞的培养上清中,所述流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原的表达量与总蛋白的表达量的比值。
18、第二方面,本发明要求保护一种融合蛋白。
19、本发明要求保护的融合蛋白自n端到c端顺次包含seq id no.1所示多肽和流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原。
20、在上述第一方面和第二方面中,流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victorialineage)ha抗原的氨基酸序列具体可如seq id no.3所示。
21、在第二方面中,进一步地,所述融合蛋白具体可为将seq id no.1所示多肽融合于流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原的n端所得。
22、在本发明的具体实施方式中,所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5的第1-549位(sp1信号肽+ha抗原)或第1-554位所示(sp1信号肽+ha抗原+linker)或如seq idno.5(sp1信号肽+ha抗原+linker+his标签)所示。
23、seq id no.5的第1-19位为信号肽sp1(即seq id no.1),第20-549位为所述流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原,第550-554位为linker接头,第555-562位为组氨酸标签。
24、第三方面,本发明要求保护编码前文第二方面所述融合蛋白的核酸分子。
25、本发明所要求保护的核酸分子自5’端到3’端顺次包含seq id no.1所示多肽的编码基因和流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原的编码基因。
26、更进一步地,所述seq id no.1所示多肽的编码基因可为如下任一:
27、(a1)seq id no.2所示的dna分子;
28、(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码seq id no.1所示多肽的dna分子;
29、(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码seq id no.1所示多肽的dna分子。
30、更进一步地,所述流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原的编码基因可为如下任一:
31、(b1)seq id no.4所示的dna分子;
32、(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且相同蛋白质的dna分子;
33、(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码相同蛋白质的dna分子。
34、在本发明的具体实施方式中,所述核酸分子可为seq id no.7的第7-1659位(kozak序列+sp1编码基因+ha抗原编码基因)或第7-1674位所示dna分子(kozak序列+sp1编码基因+ha抗原编码基因+linker编码序列)或第7-1698位所示dna分子(kozak序列+sp1编码基因+ha抗原编码基因+linker编码序列+his标签编码序列)或seq idno.7所示dna分子。
35、seq id no.7的第1-6位为hindiii酶切位点,7-12位置为kozak序列,13-69位为人工信号肽sp1编码基因,第70-1659位为ha抗原编码基因,1660-1674为linker接头,1675-1698为组氨酸标签,1699-1701为终止密码子,1702-1709为paci酶切位点。
36、第四方面,本发明要求保护含有前文第三方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
37、其中,所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第二方面中所述融合蛋白的dna,该dna不仅包括启动目的基因转录的启动子,还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
38、在本发明的具体实施方式中,所述重组载体为将seq id no.7所示dna片段(seqid no.7的第13-69位为信号肽sp1的编码基因,即seq id no.2)插入到pcgs3载体的多克隆位点(如hind iii和pac i)后得到的重组质粒。相应地,所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到expi293f细胞后所得。
39、第五方面,本发明要求保护前文第二方面所述融合蛋白或前文第三方面所述的核酸分子或前文第四方面所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用:
40、p1、提高流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原在宿主细胞中的分泌表达产量;
41、p2、提高流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原在宿主细胞中的分泌表达效率;
42、p3、制备流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌蛋白制品。
43、其中,所述宿主细胞为真核宿主细胞。
44、进一步地,所述真核宿主细胞可为hek293细胞,cho细胞,酵母细胞和昆虫细胞等。
45、在本发明的具体实施方式中,所述宿主细胞具体为expi293f细胞。
46、第六方面,本发明要求保护一种制备流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌蛋白的方法。
47、本发明要求保护的制备流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victorialineage)ha抗原分泌蛋白的方法,可包括如下步骤:
48、(a1)将前文第三方面所述的核酸分子导入宿主细胞,得到重组细胞;
49、(a2)培养所述重组细胞,从培养上清中获得流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌蛋白。
50、其中,所述核酸分子可通过前文所述重组载体导入所述宿主细胞。
51、步骤(a1)中,所述宿主细胞为真核宿主细胞。如:hek293细胞,cho细胞,酵母细胞和昆虫细胞等。
52、在本发明的具体实施方式中,所述宿主细胞具体为expi293f细胞。
53、步骤(a2)中,所述培养为培养至细胞活率降至65%-75%时终止培养。
54、步骤(a2)中,是按照包括如下步骤的方法从所述培养上清中获得流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌蛋白的:收集培养物于3500g离心30min,收集上清进行超滤浓缩和镍柱纯化。
55、本发明采用ha抗原的天然信号肽ha,人工设计信号肽sp1和白蛋白信号肽al三种信号肽引导流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原真核细胞分泌表达。研究证明:人工合成信号肽sp1实验组的流感毒株b/austria/1359417/2021(b/victoria lineage)ha抗原分泌表达量显著优于天然信号肽ha实验组,更适用于大规模工业化生产,降低生产成本。本发明适用于疫苗开发中的抗原制备等应用。
56、本发明采用真核细胞分泌表达方式制备b/austria/1359417/2021(b/victorialineage)的ha抗原,具有以下优势:1)分泌上清蛋白背景低,易于纯化;2)可溶性表达,避免形成包涵体;3)信号肽酶精准切割,n端无冗余met残基,产生符合预期的蛋白序列。
57、本发明适用于流感疫苗开发中的抗原制备等应用。对流感疫苗开发具有重要意义。