HSV免疫原性重组蛋白、其制备方法和应用、以及用其制备的疫苗与流程

本技术属于生物医药工程领域，特别涉及一种hsv免疫原性重组蛋白及其制备方法和在制备疫苗中的应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)是最常见的人类感染病毒之一，广泛存在于自然界中，主要通过皮肤、粘膜和神经组织感染宿主而引起病变。hsv可分为hsv-1和hsv-2两种血清型，hsv-1感染人体后主要引起唇疱疹、咽炎、角膜炎，甚至能引起散发性脑炎等严重疾病；hsv-2主要通过破损皮肤及黏膜感染引起生殖器疱疹、新生儿疱疹等。

2、hsv是双股dna病毒，呈球形，由核心、衣壳、被摸、包膜组成，病毒颗粒直径约150～200nm。其包膜表面有gb、gc、gd、ge、gf、gg、gh、gi、gj、gk、gl、gm等12种糖蛋白，其中gb、gd、gh、gk和gl是感染细胞所必需的。非必要的病毒糖蛋白gc在病毒与细胞受体、细胞蛋白多糖的硫酸肝素部分的初始关联中起着主要作用，而gc与ge/gi蛋白均与hsv病毒的免疫逃逸有关。

3、hsv感染的第一步是膜融合，与之相关的蛋白为gb、gd以及gh/gl，这些蛋白对于hsv入侵细胞起到重要作用，其介导的hsv病毒融合过程如下：(1)gd蛋白结合受体并发生构象改变；(2)构象改变的gd促进gh/gl转化为能够与gb相互作用的形式，从而激活gb；(3)被激活的gb必须和gh/gl一起促使病毒附着在细胞膜上。其中，只有gb被认为具有促进融合的作用，其在hsv融合过程中发生构象改变，可以诱导产生特异性中和抗体，也能产生cd4+和cd8+t细胞免疫。

4、gb蛋白在所有疱疹病毒家族中都高度保守，也是体液免疫和细胞免疫的重要靶点，也因此成为hsv疫苗研发中的重要基因。gb蛋白由ul27基因编码，全长904个氨基酸，结构如图1所示，从n端至c端依次为信号肽(signal peptide，sp)、胞外域(extracellulardomain，ecd)、膜近端区(membrane proximal region，mpr)、跨膜结构域(transmembranedomain，tm)以及胞浆区(cytoplasmic domain，ctd)。gb蛋白的融合能力来源于胞外域，其中包含i、ii、iii、iv、v五个区域，其中i和ii为融合(fusion)结构域(vollmer,b.,et al.,the prefusion structure of herpes simplex virus glycoprotein b.sci adv,2020.6(39))。天然gb蛋白是三聚体结构，通过与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白结合，促进病毒膜与细胞膜的融合，进而介导病毒进入细胞。因此，针对gb蛋白的免疫保护是防止感染的第一步。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种hsv免疫原性重组蛋白、其制备方法和应用、以及用其制备的预防hsv感染的疫苗。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明一方面提供了一种hsv免疫原性重组蛋白，所述重组蛋白包含hsv-1与hsv-2中至少一项的gb蛋白胞外域或其功能片段，或者与所述gb蛋白胞外域或其功能片段的序列至少90％相同；其中，所述功能片段至少包含hsv-1与hsv-2中至少一项的gb蛋白胞外域的i和ii结构域。

4、进一步地，所述重组蛋白包含hsv-1的gb蛋白胞外域或其功能片段和hsv-2的gb蛋白胞外域或其功能片段。

5、进一步地，所述hsv-1的gb蛋白胞外域或其功能片段的c端与所述hsv-2的gb蛋白胞外域或其功能片段的n端直接连接或间接连接，或者所述hsv-2的gb蛋白胞外域或其功能片段的c端与所述hsv-1的gb蛋白胞外域或其功能片段的n端直接连接或间接连接。

6、例如，在一个实施方式中，所述hsv-1的gb蛋白胞外域的c端与所述hsv-2的gb蛋白胞外域的n端直接连接或间接连接。在一个实施方式中，所述hsv-1的gb蛋白胞外域的功能片段的c端与所述hsv-2的gb蛋白胞外域的功能片段的n端直接连接或间接连接。在一个实施方式中，所述hsv-1的gb蛋白胞外域的功能片段的c端与所述hsv-2的gb蛋白胞外域的n端直接连接或间接连接。在一个实施方式中，所述hsv-1的gb蛋白胞外域的c端与所述hsv-2的gb蛋白胞外域的功能片段的n端直接连接或间接连接。

7、在另一个实施方式中，所述hsv-2的gb蛋白胞外域的c端与所述hsv-1的gb蛋白胞外域的n端直接连接或间接连接。在另一个实施方式中，所述hsv-2的gb蛋白胞外域的功能片段的c端与所述hsv-1的gb蛋白胞外域的功能片段的n端直接连接或间接连接。在另一个实施方式中，所述hsv-2的gb蛋白胞外域的功能片段的c端与所述hsv-1的gb蛋白胞外域的n端直接连接或间接连接。在另一个实施方式中，所述hsv-2的gb蛋白胞外域的c端与所述hsv-1的gb蛋白胞外域的功能片段的n端直接连接或间接连接。

8、进一步地，所述gb蛋白胞外域或其功能片段发生至少一处氨基酸突变。

9、进一步地，所述重组蛋白的氨基酸序列与seq id no.1～7中的任一项至少90％相同。

10、本发明另一方面提供了上述hsv免疫原性重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

11、s1：合成所述重组蛋白对应的dna序列，并克隆到质粒载体上；

12、s2：用所述质粒载体转染宿主细胞、并进行表达，所述宿主细胞为真核细胞；

13、s3：对培养产物进行纯化，得到所述重组蛋白。

14、进一步地，所述质粒载体为prk1.6载体或pcdna3.1载体。

15、进一步地，步骤s2中，对所述宿主细胞进行转染的方法如下：

16、用培养基将转染体系稀释10倍，得到孵育体系；

17、按比例将pei混合物加入到dna混合物中，静置孵育1～10min(例如5min)；

18、将pei-dna混合体系与所述宿主细胞混合，进行培养。

19、进一步地，所述宿主细胞为expi cho-s细胞。

20、进一步地，步骤s2中，扩增使用的培养基为emcd cho-s 203培养基。

21、进一步地，用所述质粒载体转染所述宿主细胞时dna用量为1μg/ml，pei与dna溶液的体积比为2:1～6:1，具体可以为2:1、3:1或4:1，优选为6:1。

22、进一步地，所述培养的环境条件为37±2℃、8％ co2、100～150rpm(例如120rpm)的潮湿培养箱。

23、进一步地，所述培养还包括如下步骤：

24、培养24h后，降温至32±2℃继续培养3～8天。

25、进一步地，所述培养还包括如下步骤：

26、在培养的第1、3、5天分别按3～8％(例如5％)的体积比进行培养基补料，补料成分为sigma公司的advanced feed1或em-s1f。

27、进一步地，步骤s3中，对所述培养产物进行纯化的方法为采用金属螯合层析进行纯化，用咪唑-pbs体系进行洗脱。

28、进一步地，还包括在用金属螯合层析进行纯化前进行的如下步骤：

29、对所述培养产物进行离心和过滤，向过滤后的发酵液中添加咪唑，使发酵液中咪唑的终浓度为5～15mm(例如10mm)。

30、进一步地，所述咪唑-pbs体系包括用于在层析后对层析柱上附着的杂质进行清洗的清洗液、以及用于在清洗后对吸附在所述层析柱上的蛋白进行洗脱的洗脱液，所述清洗液为含10～50mm(例如30mm)咪唑的pbs缓冲液，所述洗脱液为含200～1000mm(例如500mm)咪唑的pbs缓冲液。

31、进一步地，还包括在洗脱后进行的如下步骤：

32、对洗脱的蛋白进行浓缩离心，之后添加10～20倍体积的pbs缓冲液、混合均匀后再进行离心，重复三次，置换蛋白溶液的溶剂并进行稀释。

33、进一步地，步骤s3中，所有反应体系的ph值均控制在7～8，例如7.4。

34、本发明还提供了上述重组蛋白在制备预防hsv感染的疫苗中的应用。

35、进一步地，所述重组蛋白在单剂疫苗中的使用剂量为20～80μg(例如50μg)。

36、进一步地，所述疫苗中，所述重组蛋白与至少一种免疫佐剂组合使用，所述免疫佐剂选自铝佐剂、角鲨烯、生育酚、mpl、lpa、cpg、poly(i:c)以及qs-21中的至少一种。

37、进一步地，所述重组蛋白的人用剂量为40～160μg，分散于间隔14～28天施用的两剂相同剂量的疫苗中。

38、本发明第四方面提供一种用于预防hsv感染的疫苗，包括上述重组蛋白；所述疫苗针对hsv-1和hsv-2两种血清型中的至少一种提供保护。

39、进一步地，单剂疫苗中含有所述重组蛋白20～80μg。

40、进一步地，单剂疫苗中含有所述重组蛋白50μg。

41、进一步地，还含有免疫佐剂，所述免疫佐剂选自铝佐剂、角鲨烯、生育酚、mpl、lpa、cpg、poly(i:c)以及qs-21中的至少一种。

42、进一步地，所述免疫佐剂为mpl和qs-21。

43、进一步地，单剂疫苗中包含mpl 10～100μg(例如50μg)和qs-21 10～100μg(例如50μg)。

44、进一步地，所述免疫佐剂为cpg。

45、进一步地，单剂疫苗中包含cpg 2.5～5mg(例如3.155mg)。

46、进一步地，所述免疫佐剂为cpg和氢氧化铝。

47、进一步地，单剂疫苗中包含cpg 2.5～5mg(例如3.155mg)、氢氧化铝0.1～1mg(例如0.5mg)。

48、进一步地，所述疫苗包括成分相同、间隔14～28天(例如21天)施用的第一剂次和第二剂次。

49、本发明的有益效果如下：本发明提供了一种hsv免疫原性重组蛋白，包含gb蛋白胞外域或其功能片段，提供与hsv病毒入侵细胞直接相关的高度保守的表位，能有效刺激特异性中和抗体和细胞因子产生，激发较高水平的体液免疫和细胞免疫；应用该重组蛋白制备的疫苗可以针对多种hsv毒株产生良好的免疫效果，从而提供广谱而高效的保护，有效预防hsv感染。