S-MN特异性芳香基硫酸酯酶的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种s-mn特异性硫酸酯酶的制备方法及其应用。

背景技术：

1、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,pcc)起源于肾上腺髓质,副神经节瘤(paraganglioma,pgl)是起源于肾上腺外的交感神经链并具有激素分泌功能的神经内分泌肿瘤，pcc肿瘤位于肾上腺,pgl肿瘤位于胸、腹部和盆腔的脊椎旁交感神经链，二者合称为ppgl，主要临床表现是高血压(90％-100％)，诊断ppgl的实验室检查首选血浆游离或尿液甲氧基肾上腺素(metanephrine，mn)、甲氧基去甲肾上腺素(normetanephrine，nmn)的浓度测定。在尿液中mns多数以硫酸盐结合态的形式存在(s-mn)，因此在检测前需要进行预处理获得游离的mns。尿中的肾上腺素通常是在酸水解步骤之后或通过用芳基硫酸酯酶进行酶处理以从酚基团上裂解硫酸根部分来测量的。但是酸解的方法需要100℃高温和浓酸，操作危险且繁琐，易造成裂解不完全。使用芳基硫酸酯酶对尿液进行酶解处理条件更加温和、安全。

2、硫酸酯酶在土壤微生物和哺乳动物的组织细胞中广泛分布，目前在假单胞菌属、鼠伤寒沙门氏菌属、绿脓假单胞菌属等细菌，鲍鱼、罗曼蜗牛等动物中均有报道。来源于假单胞菌属和绿脓假单胞菌属的天然和重组硫酸酯酶在工业中多用于去除琼脂中的硫酸脂基团，增大琼脂的扩散系数。

3、尿液样本中s-mn硫酸脂基团的特异性酶切的主流操作均采用从产气肠杆菌中提取的硫酸酯酶，其他来源的硫酸酯酶均无法特异性切割s-mn中的硫酸脂基团。但产气肠杆菌来源的硫酸酯酶价格昂贵，无法大量应用于诊断试剂盒，因此仍需要开发出一种低成本，高特异性，能够广泛应用于临床诊断的s-mn硫酸脂基团特异性酶。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种s-mn特异性硫酸酯酶的制备方法及其应用。本发明提供的s-mn特异性硫酸酯酶，由肺炎克雷伯菌表达产生，并且在培养基中高效表达，能够高效处理尿液中的s-mn硫酸脂基团。

2、本发明提供了肺炎克雷伯菌在制备s-mn特异性芳香基硫酸酯酶中的应用。

3、具体的，本发明所述的肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科克雷伯氏菌属。单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。研究发现肺炎克雷伯菌能够分泌硫酸酯酶。本发明实施例中以肺炎克雷伯菌标准株为例，进行s-mn特异性硫酸酯酶的提取，肺炎克雷伯菌标准株的编号为atcc27736。试验结果表明该肺炎克雷伯菌标准株可高效表达s-mn特异性硫酸酯酶,摇瓶条件下表达量可达1000u/l。在相同条件下，本发明所述的s-mn特异性硫酸酯酶的酶解效果优于其他来源的硫酸酯酶。

4、本发明提供了s-mn特异性芳香基硫酸酯酶的制备方法，包括用培养基培养肺炎克雷伯菌后经纯化得到芳香基硫酸酯酶。

5、本发明所述培养基为香基硫酸酯酶分泌诱导培养基，其组分包括：0.1wt％～1wt％nh4cl、0.01wt％～0.1wt％mgcl2·6h2o、0.001wt％～0.01wt％nacl、0.001wt％～0.01wt％mncl2·4h2o、0.001wt％～0.01wt％fecl2·6h2o、0.5wt％～5wt％木糖、50～500mmol/l磷酸盐和1～10mmol/l甲硫氨酸。

6、具体的，在一些实施例中，本发明提供的香基硫酸酯酶分泌诱导培养基的组分包括：0.1％ nh4cl、0.01％ mgcl2·6h2o、0.001％nacl、0.001％mncl2·4h2o、0.001％fecl2·6h2o、0.5％木糖、50mmol/l磷酸盐和1mmol/l甲硫氨酸。

7、本发明所述培养肺炎克雷伯菌的步骤包括将活化后的肺炎克雷伯菌菌液接种到培养基中37℃，230rpm培养20h；所述肺炎克雷伯菌菌液的接种量为0.1％(v/v)。

8、具体的，在一些实施例中，本发明所述活化肺炎克雷伯菌的步骤具体包括：将冻存的肺炎克雷伯菌菌液放到室温融化，接种到血平板进行培养，挑取单菌落接入3ml芳香基硫酸酯酶分泌诱导培养基中，置于台式恒温振荡器37℃,230rpm，培养至od600值至0.6～1.0，取1ml菌液接种至1l上述培养基，37℃,230rpm培养20h,收获菌体。

9、本发明所述纯化包括将菌液第一次离心后复溶菌沉淀，将复溶后的缓冲液超声破碎后第二次离心取上清液，将上清液经过滤、目的蛋白纯化并脱盐洗滤后得到所述芳香基硫酸酯酶。

10、具体的，在一些实施例中，本发明所述纯化的步骤具体包括菌体破碎和目的蛋白纯化，所述蛋白纯化包括离子交换层析以及脱盐洗滤；

11、所述菌体破碎的步骤包括：将菌悬液离心取沉淀，按照0.1g/5ml的比例添加0.5mg/ml溶菌酶缓冲液复溶菌沉淀，复溶后的缓冲液在4℃冷柜内搅拌2h后进行超声破碎。所述破碎后菌悬液进行10000rpm离心20min，去沉淀取上清，用0.22um滤膜进行过滤。

12、所述离子交换层析采用deae sepharosetm fast flow层析柱，所述层析包括柱平衡、上样和洗脱的步骤；所述柱平衡步骤中采用的缓冲液为0.01mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液；所述上样步骤中采用的缓冲液为0.01mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液；所述洗脱步骤中采用的缓冲液为0.01mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液和0.1mol/l，ph值为7.5的氯化钠缓冲液。

13、所述脱盐洗滤采用分子截留量10kd的中空纤维膜，所述洗滤的缓冲液为0.01mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液。

14、所述洗滤完成后，添加50％甘油进行保存。

15、本发明提供了利用本发明所述制备方法获得的s-mn特异性芳香基硫酸酯酶。本发明提供一种来源于肺炎克雷伯菌的硫酸酯酶，可高特异性切割s-mn中的硫酸脂基团，能够应用于临床诊断检测s-mn过程中对样本的前处理。

16、具体的，在一些实施例中，利用本发明所述制备方法获得的芳香基硫酸酯酶在不同的稀释倍数，酶活性优于市售芳香基硫酸酯酶。

17、本发明还提供了芳香基硫酸酯酶酶活性的测定方法，具体包括：将20ul纯化的酶液添加80ul，20mmol/l的对硝基硫酸钾(p-np，50mmol/l tris-hcl缓冲液配制)，50℃温育10min后，加入25ul 1mol/l naoh终止反应，蒸馏水补足体积至1ml，在410nm下测定吸收值。

18、本发明还提供了s-mn特异性芳香基硫酸酯酶在制备处理样本中硫酸酯基团的试剂盒中的应用。

19、本发明还提供了处理尿液样本中s-mn硫酸脂基团的方法，其包括利用本发明所提供的s-mn特异性芳香基硫酸酯酶进行酶切处理。

20、本发明提供的方案中，肺炎克雷伯菌高效表达的s-mn特异性硫酸酯酶，具有活性高、特异性好、成本低的优点。能够高效处理尿液中的s-mn硫酸脂基团，在相同条件下，处理尿液样本的酶解效果优于高温酸解和sigma硫酸酯酶，并且使用芳基硫酸酯酶对尿液进行酶解处理的条件更加温和、安全，对于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的临床诊断具有重要意义。