一种梯棱羊肚菌SSR分子标记及其引物和应用

本发明属于分子生物学，具体涉及一种梯棱羊肚菌ssr分子标记及其引物和应用。

背景技术：

1、羊肚菌是一种名贵的珍稀食用菌，不但味道鲜美、口感脆嫩，还富含多种生物活性成分，具有抗癌、抗肿瘤、抗疲劳、提高免疫力、保肝护肝等功效，深受人类的青睐。梯棱羊肚菌是目前大面积推行的可栽培品种之一，具有抗温差波动能力强，适应性广，产量稳定的优势，近年来在全国各地推广较多。然而，由于前端的遗传育种研究基础薄弱，品种选育工作难以推进，且市场上品种的肆意传代导致的活力退化现象也常有发生，如相同的菌株在各地表现差异明显，甚至出现一些区域高产，一些区域绝收的极端案例。

2、简单重复序列(ssrs，simplesequencerepeats)，又叫做微卫星位点(microsatellites)，是由1～6bp的重复单元串联重复而成的序列，具有序列变异度高、稳定性高、共显性等优势，已在动物、植物和微生物中广泛使用，同时，ssr分子标记也广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等研究中。

3、传统的ssr标记开发借助常规的重复序列富集pcr扩增、issr(inter-simplesequence repeat)转化、est-ssr(expressed sequence tag-simple sequence repeat)序列开发、以及简单的依靠单一的基因组序列查找ssr位点进行开发检测。现有技术1(刘伟,等.粗柄羊肚菌转录组的ssr分布和序列特征分析.轻工学报,2017,32(02):33-39)基于粗柄羊肚菌的转录组数据分析了其ssr分布和序列特征分析。现有技术2(孟清,等.青海小海绵羊肚菌m12-10转录组ssr信息分析及其分子标记开发.青海大学学报,2019,37(06):1-10)同样基于小海绵羊肚菌转录组数据进行ssr信息分析和分子标记的开发，其中随机筛选的12对ssr引物中4对引物表现稳定可重复的多态性，并对收集的19株羊肚菌进行了遗传多样性分析。现有技术3(马杰,等.基于转录组序列的羊肚菌est-ssr标记开发与遗传多样性分析.江苏农业学报,2020,36(05):1282-1290)同样利用转录组数据对羊肚菌进行了est-ssr的开发，并筛选得到15对稳定性较好的ssr引物，对33份羊肚菌标本进行了遗传多样性分析。现有技术4(du xh et al.hybridization,characterization and transferabilityof ssrs in the genus morchella.fungal biology,2019,123(7):528-538)基于一个梯棱羊肚菌基因组数据的ssr特征分析，设计了一套适用于m.importuna，m.sextelata，m.eximia，m.exuberans，mel-13和mel-21的ssr分子标记。以上现有技术设计ssr标记的多态性较低，稳定性差，不能有效区分梯棱羊肚菌。

技术实现思路

1、本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种多态性高、稳定性好的梯棱羊肚菌ssr分子标记及其引物和应用，有效鉴定梯棱羊肚菌物种，用于群体遗传多样性分析。

2、本发明提供了一种梯棱羊肚菌ssr分子标记，所述的ssr分子标记包括核苷酸序列分别如seq id no.1～35所示的ssr01、ssr02、ssr03、ssr04、ssr05、ssr06、ssr07、ssr08、ssr09、ssr10、ssr11、ssr12、ssr13、ssr14、ssr15、ssr16、ssr17、ssr18、ssr19、ssr20、ssr21、ssr22、ssr23、ssr24、ssr25、ssr26、ssr27、ssr28、ssr29、ssr30、ssr31、ssr32、ssr33、ssr34和ssr35。

3、本发明还提供了扩增上述技术方案所述的梯棱羊肚菌ssr分子标记的引物组合，所述引物组合包括正向引物组合和反向引物组合；

4、所述正向引物组合的核苷酸序列如seq id no.36～70所示；

5、所述反向引物组合的核苷酸序列如seq id no.71～105所示。

6、本发明还提供了上述技术方案所述的ssr分子标记或引物组合在下述(a)～(d)中的一种或多种中的应用：

7、(a)构建梯棱羊肚菌分子指纹图谱；

8、(b)梯棱羊肚菌筛选；

9、(c)梯棱羊肚菌种质资源鉴定；

10、(d)梯棱羊肚菌遗传多样性分析。

11、本发明还提供了一种梯棱羊肚菌的分子指纹图谱，所述分子指纹图谱由上述技术方案所述的引物组合所构建。

12、本发明还提供了一种梯棱羊肚菌遗传多样性分析试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组合。

13、本发明还提供了一种梯棱羊肚菌遗传学的分析方法，包括如下步骤：

14、以梯棱羊肚菌基因组dna作为模板，利用上述技术方案所述的引物组合进行pcr扩增，得到扩增产物；

15、电泳检测所述扩增产物，获得ssr位点多态性扩增条带；

16、根据扩增条带进行遗传多样性分析。

17、优选的，所述pcr扩增的反应体系以20μl计，由mix 17μl、10μm正向引物1μl、10μm反向引物1μl和25-50ng/μl梯棱羊肚菌基因组dna 1μl组成。

18、优选的，所述pcr扩增的程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，35个循环；72℃终延伸5min。

19、优选的，所述遗传多样性分析包括计算遗传多样性指标。

20、优选的，所述遗传多样性指标包括等位基因、有效等位基因、私有等位基因和香农指数中的一种或多种。

21、本发明提供了一种梯棱羊肚菌ssr分子标记，具体包括40个ssr分子标记；所述ssr分子标记的核苷酸序列分别如seq id no.1～35所示。本发明以梯棱羊肚菌m04m24(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/gca_003444645.1)和梯棱羊肚菌m04m26(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/gca_003444635.2)的基因组数据为基础，整合4个新的梯棱羊肚菌菌株20d11a(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srr16686487)、20d13a(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srr16686505)、20d21a(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srr16686497)和20d24a(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/srr16686494)，通过6套梯棱羊肚菌基因组水平的比较分析，进行梯棱羊肚菌通用型ssr分子标记的开发，最终得到35条多态性高，稳定性好的ssr位点，可用于梯棱羊肚菌物种的鉴定、群体遗传多样性分析等，具有较好的应用价值。