一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种利用定量pcr法分析黄瓜和小麦根系互作的方法。

背景技术：

1、根系研究是农业生产和植物互作等领域的重要研究方向，根系是植物的重要器官，根系在作物吸收水分和养分中承担着重要功能，对植物生长和发育具有重要作用。对影响植物根系分布的因素的理解与我们对基本生态系统功能(生产力)的理解密切相关，因此研究作物生长过程中的根系生物量及根系分布对于理解地下竞争及物种的相互作用有重要意义。在农业生产中，不同作物之间的根系互作现象是不可避免的。根系互作可以直接或间接地影响到作物的生长发育和产量，因此成为了近年来农业研究的热点之一。鉴定根系是研究根系互作的基础，定量根系是研究根系互作的关键。

2、目前鉴别并定量根系的方法有许多，主要是基于形态学、生理学等特征进行判断，存在局限性和误差，如根系形态法、染色法、近红外光谱识别法、同位素法、生物化学方法等。然而，这些方法均存在着一些缺点。根系形态法在物种种类繁多的情况下，由于有些植物的根系形态相似，很难进行区分；染色法研究的根系仅能在干燥的小型盆栽环境中完全染色，对研究环境有限制；近红外光谱识别法是通过模型的建立来定量估算相应的物质浓度，因此校正样品测量的浓度需要极其精确才能进行，导致了模型建立的困难；同位素技术具有两个明显的缺点：第一，同位素是存在潜在危险；第二，同位素技术无法在现场或大规模研究中使用；生物化学鉴别需要对根系进行化学成分的分析，操作复杂。这就无法满足现代农业对快速、准确检测根系的需求，同时最大的缺陷在于，试验容易因为环境因素改变而导致植物组织的化学物质成分改变，从而降低了准确性。利用分子生物学技术，如pcr和定量pcr扩增，可以通过对根系的基因组dna进行分析，快速、准确地鉴别并(半)定量根系的种类、性质和生物量；但此方法可能会由于特异性引物不够特异，从而受到污染和干扰，影响结果。因此有必要开发新的高效、准确的根系鉴定及定量方法，以提高根系互作研究的效率和准确性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用定量pcr法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的方法可以高效并准确地鉴别并定量黄瓜和小麦根系，提高植物根系互作研究的效率和准确性。

2、内转录间隔区(internal transcribed space，its)是指位于真核生物rrna基因转录单元内部的一段非编码dna序列，包括两个its(its1、its2)，中间是5.8s rdna，其上游是18s rdna，下游是28s rdna，其长度和序列在不同物种中具有高度的变异性，因此its序列在物种间有较高的特异性。由于its序列在物种间具有高度的变异性的特性，因此可以设计特异性引物来放大its序列，从而实现对不同物种的特异性检测和鉴定。同时its序列长短适中，易于pcr扩增和测序。本发明利用黄瓜和小麦的its区设计得到了特异性引物，可以用于检测黄瓜和小麦作物的根系，通过构建黄瓜和小麦已知根生物量与目的基因拷贝数间的回归方程，接着利用定量pcr测量出未知根系的拷贝数，从而计算出未知根系生物量。

3、基于此，本发明提供了如下方案：

4、本发明提供一种鉴定黄瓜根系的its分子标记，所述its分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明还提供一种鉴定黄瓜根系的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如seq id no.5-6所示。

6、本发明还提供一种鉴定黄瓜根系的方法，包括以下步骤：

7、(1)获取待检根系的基因组dna；

8、(2)以所述基因组dna为模板，利用鉴定黄瓜根系的特异性引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

9、(3)对所述扩增产物进行电泳检测，如果出现与上述鉴定黄瓜根系的its分子标记相同的扩增条带，则代表所述待检根系为黄瓜根系。

10、本发明还提供一种黄瓜根系生物量的定量检测方法，包括以下步骤：

11、(1)利用鉴定黄瓜根系的特异性引物，对不同生物量的黄瓜根系的dna进行定量pcr反应，构建回归方程，所述回归方程以黄瓜根系生物量为x轴，以定量pcr获得的基因拷贝数为y轴；

12、(2)利用鉴定黄瓜根系的特异性引物，对待检样品的nda进行定量pcr，获得基因拷贝数，之后根据所述回归方程，计算得出所述待检样品中的黄瓜根系的生物量；

13、在步骤(2)中，所述定量pcr的反应体系和反应程序与步骤(1)相同。

14、本发明还提供一种鉴定小麦根系的its分子标记，所述its分子标记的核苷酸序列如seq id no.2所示。

15、本发明还提供一种鉴定小麦根系的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如seq id no.15-16所示。

16、本发明还提供一种鉴定小麦根系的方法，包括以下步骤：

17、(1)获取待检根系的基因组dna；

18、(2)以所述基因组dna为模板，利用鉴定小麦根系的特异性引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

19、(3)对所述扩增产物进行电泳检测，如果出现与上述鉴定小麦根系的its分子标记相同的扩增条带，则代表所述待检根系为小麦根系。

20、本发明还提供一种小麦根系生物量的定量检测方法，包括以下步骤：

21、(1)利用鉴定小麦根系的特异性引物，对不同生物量的小麦根系的dna进行定量pcr反应，构建回归方程，所述回归方程以小麦根系生物量为x轴，以定量pcr获得的基因拷贝数为y轴；

22、(2)利用鉴定小麦根系的特异性引物，对待检样品的dna进行定量pcr，获得基因拷贝数，之后根据所述回归方程，计算得出所述待检样品中的小麦根系的生物量；

23、在步骤(2)中，所述定量pcr的反应体系和反应程序与步骤(1)相同。

24、本发明还提供以下(1)或(2)任一项所述的物质在黄瓜和小麦的互作分析中的应用：

25、(1)上述鉴定黄瓜根系的its分子标记和鉴定小麦根系的its分子标记；

26、(2)上述鉴定黄瓜根系的特异性引物和鉴定小麦根系的特异性引物。

27、本发明还提供一种利用定量pcr法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，包括利用上述鉴定黄瓜根系和小麦根系的方法进行根系鉴定，并采用分层分段挖掘法，利用上述的黄瓜根系生物量的定量检测方法和小麦根系生物量的定量检测方法进行根系生物量检测，得到所述黄瓜和所述小麦的根系生物量及水平和/或垂直分布情况的步骤。

28、本发明公开了以下技术效果：

29、本发明以黄瓜和小麦为供试材料，分别设计出各自的特异性引物，利用定量pcr分别建立黄瓜和小麦已知根生物量与目的基因拷贝数间的回归方程；通过比较利用定量pcr法和人工法测定的单作黄瓜根系生物量及根系分布的结果，来证明定量pcr法的可行性，最后比较利用两种方法测定的小麦伴生黄瓜体系中黄瓜和小麦的根系生物量及根系分布的结果，来证明了定量pcr法相较于人工法更适用于研究多种作物共同生长环境下的根系分布。本发明为能够在复杂的土壤环境中准确识别并定量目标作物根系提供了一种有效的工具和方法。