一种基于祖先序列重建的糖基转移酶及其应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种基于祖先序列重建的糖基转移酶及其突变体。

背景技术：

1、糖苷类化合物是植物在生长发育过程中形成的次级代谢产物，是水果、鲜花以及许多经济作物如茶叶和烟草等的香气源。在这些植物组织中，挥发性气味物质以键合态糖苷的形式合成并积累下来，并在失水、离体、机械损伤、病虫侵染等特定条件下，糖苷键被水解并释放出苷元，表现出气味、抗病虫等生命特征。糖苷的合成和应用研究在化工、食品、农业和医药等领域都广受关注。化学合成糖苷化合物技术相对成熟，但是由于反应过程中步骤繁琐，而且容易产生化学残留，应用范围受到很大限制。酶法合成糖苷化合物反应条件温和、选择性高并可直接以非保护的游离糖作为底物，近年来引起人们广泛关注。

2、苯乙醇苷类化合物结构广泛相似，有较强的生物活性，在植物中分布广泛，但含量较低，分离提取困难，且样品提取量少，因此很有必要进行苯乙醇苷类化合物的合成研究。

3、2-苯乙醇(2-pe)是一种具有玫瑰香味的芳香醇，存在于许多精油和发酵食品中。目前，2-苯乙醇的生产主要依赖苯—环氧乙烷法和氧化苯乙烯加氢法这两种化学方法合成。这两种化学合成方法都涉及有毒试剂和恶劣的条件，因此会产生副产品，从而降低最终产物的质量。化学法合成的2-pe价格低廉，而天然2-pe具有昂贵的价格优势。生物技术路线可以通过一种环境友好的工艺提供高纯度的“天然”2-pe，但由于2-pe具有细胞毒性，在生物技术路线中的产量受到限制，利用糖基转移酶将2-pe转化为2-苯乙醇糖苷可以有效降低2-pe对细胞的毒性，后期通过水解酶水解2-苯乙醇糖苷的方法可以极大程度提高2-pe的产量。

4、红景天苷是红景天植物的一种关键药效成分，具有耐缺氧、抗肿瘤、抗衰老和保护心血管等显著功效。红景天苷的需求量与日俱增，其生物合成途径引起研究者的密切关注。其合成途径中最后一步反应为酪醇(对羟基苯乙醇)糖基化反应，催化该反应的关键酶是尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ugt)。筛选高活性糖基转移酶基因对生物体内调节或体外合成红景天苷具有重要意义。

5、祖先序列重建技术(asr)使用现存蛋白质序列作为模板进行比对，通过描述蛋白质家族历史的系统发育和分子进化过程模型来推断其古代祖先蛋白质的序列，使研究人员能够直接研究序列进化对蛋白质的结构和功能。此外，重建的祖先蛋白质序列可用于填充序列空间，从而有助于远程同源性推断。现有的祖先序列重建方法可分为两大类：最大简约(mp)法和最大似然(ml)法，ml法通常比mp方法结果更为可靠。祖先序列重建技术逐渐成为研究酶序列，结构和功能关系的有力手段。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于祖先序列重建的糖基转移酶及其突变体编码基因及其蛋白序列，所述糖基转移酶与来自木薯(manihot esculenta)的糖基转移酶xp_021605632.1有79.39％的序列相似性。由糖基转移酶ugt85a家族所有序列重建获得(http://prodata.swmed.edu/ancescon/ancescon.php)。

2、本发明的另一目的是提供上述糖基转移酶及其突变体在催化r’-苯乙醇转化为r’-苯乙醇糖苷中的应用。

3、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

4、一种基于祖先序列重建的糖基转移酶ugtan85，其氨基酸序列为：

5、1)seq id no.2所示的氨基酸序列；

6、2)seq id no.2所示的氨基酸序列经保守变异得到的氨基酸序列，即经替换、缺失或添加氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

7、编码所述的糖基转移酶ugtan85的核酸分子。

8、所述的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。

9、一种表达载体，包含上述的核酸分子。

10、一种含有上述任一项所述核酸分子或所述表达载体的宿主细胞。

11、所述的宿主细胞是选自细菌、酵母、植物细胞、动物细胞。

12、所述糖基转移酶ugtan85的制备方法，在合适的培养基中培养上述宿主细胞，经提取、纯化得到的糖基转移酶。

13、所述的糖基转移酶ugtan85或所述的核酸分子或所述的表达载体或所述的宿主细胞在催化r’-苯乙醇生成r’-苯乙醇糖苷中的应用。

14、所述的糖基转移酶ugtan85在催化r’-苯乙醇生成r’-苯乙醇糖苷中的应用，ugtan85催化以r’-苯乙醇和尿苷葡萄糖二磷酸盐(udpg)为底物生成r’-苯乙醇糖苷。

15、一种蔗糖合酶mcsusy及其突变体s31d，与所述糖基转移酶ugtan85及其突变体进行偶联，以蔗糖和r’-苯乙醇为底物生成r’-苯乙醇糖苷。

16、一种催化r’-苯乙醇生成r’-苯乙醇糖苷的方法，以r’-苯乙醇和udpg作为底物，使用所述糖基转移酶及其突变体或所述宿主细胞进行催化发生转糖基反应，生成r’-苯乙醇糖苷。

17、反应体系具体为：以2mm～40mm 2-苯乙醇、酪醇、3-氟苯乙醇、邻羟基苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇中任意一种为底物，udpg浓度为2mm～40mm，加入0.74～2μg纯化酶液，在30～55℃ph＝6～11条件下反应1～48h，使用1～6倍甲醇终止反应，离心后使用hplc检测可得对应产物糖苷。

18、所述糖基转移酶ugtan85能够催化r’-苯乙醇向r’-苯乙醇糖苷的转化；

19、将所述糖基转移酶基因编码的蛋白质命名为ugtan85；

20、含有所述编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物。

21、所述糖基转移酶及其突变体催化r’-苯乙醇向r’-苯乙醇糖苷的转化中的应用。

22、构建双酶表达体系：

23、一种以蔗糖和2-苯乙醇、酪醇、3-氟苯乙醇、邻羟基苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇中任意一种为底物催化生成苯乙醇糖苷的方法，分别以2-苯乙醇、酪醇、3-氟苯乙醇、邻羟基苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇和蔗糖作为底物，使用蔗糖合酶mcsusy或者其突变体s31d偶联糖基转移酶ugtan85或者其突变体或所述宿主细胞进行催化反应生成苯乙醇糖苷。

24、反应体系具体为：以2mm～40mm 2-苯乙醇、酪醇、3-氟苯乙醇、邻羟基苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇为底物，蔗糖浓度为6mm～400mm，加入1～6mg/ml粗酶液，在30～55℃ph＝6.5～7.5条件下反应1～48h，使用1～6倍甲醇终止反应，离心后使用hplc检测可得产物r’-苯乙醇糖苷。

25、蔗糖合酶mcsusy的核酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列seq id no.4所示。所述蔗糖合酶mcsusy突变体s31d是在蔗糖合酶mcsusy的第31号氨基酸位点将丝氨酸突变为天冬氨酸得到，核酸序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.10所示。

26、使用所述双酶偶联体系以蔗糖和2-苯乙醇、酪醇、3-氟苯乙醇、邻羟基苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇为底物，优选在55℃、ph＝7.0条件下反应。

27、粗酶液的获得方法见实施例3。

28、构建ugtan85突变体

29、基于祖先序列重建的糖基转移酶ugtan85经丙氨酸扫描、dock-design虚拟点饱和突变筛选得到活性高于野生型的突变体，在第20、23、24、65、90、93、94、220、252、312、323位氨基酸处进行突变，获得突变体y20a/c/d/e/f/g/v/m/l/h、q23a/d/e/p/h/i/l/s/t/g/v/f/w/n/k/m/c、g24a/e/c/d/f/p/y/h、n65a/e/d/h/c/s/t/g、i90a/p/h/t/s/k/m/l、l93c/s/e/f/p/g/y/w/m 、 c94a/d/e/f/g/l/m/n/f/q 、f220a/c/s/p/y/g/d/e/v/m/i/l、 t252a/c/s/n/m/p/q/d/e/g/f、i312a/f/l/m/v/p/r/t/s/y、f323a/i/v/m/d/e/s/r/g/w/c/p活性高于野生型，在以上单点突变的基础上，进行组合突变，分别获得了两株活性较高的突变体ugtan85-m1(y20a/q23d/g24a/n65d/i90l/f220p/t252s/i312t/f323a，氨基酸序列如seqid no.5所示，核酸序列如seq id no.6所示)，

30、ugtan85-m2(y20h/q23e/g24a/n65g/i90a/l93s/c94a/f220d/t252a/f323p，氨基酸序列如seq id no.7所示，核酸序列如seq id no.8所示)，上述突变株相较野生型酶活分别提升了4.68倍、5.44倍。

31、本发明基于祖先序列重建的糖基转移酶ugtan85的获得：根据cazy数据库(http://www.cazy.org/glycosyltransferase-family)中的家族分类，在uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库中下载属于ugt85a家族全部蛋白质序列。对该家族蛋白序列进行比对，修剪后上传至ancescon(http://prodata.swmed.edu/ancescon/ancescon.php)网站，通过该网站服务器选择最大似然法(ml)对ugt85a家族进行祖先序列重建，在结果中重建了82条根序列，在输出的树文件中由远及近选择了85、86和95号根序列进行分析。其中85号根序列与已报道可催化r’-苯乙醇中具有代表性的底物酪醇和2-苯乙醇的at85a1序列一致性为66.53％，通过比对pspg-box区域，并对其构建蛋白模型，分子对接分析及可溶性表达分析。最终选定85号根序列进行合成，并命名为ugtan85(图1)，经过酶的表达纯化和酶学性质表征，证实ugtan85是一种耐高温的嗜碱性糖基转移酶，其核苷酸序列全长1485碱基，编码495个氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.1和seqid no.2所示。该基因能在大肠杆菌表达体系中高效的可溶性表达，由该基因表达的重组酶酶学性质为：以r’-苯乙醇为底物，该酶的最适反应温度为55℃，最适ph为10.5，并且在55℃以下和ph 7-11的范围内具有良好的稳定性，在8h内能维持90％以上的酶活性。经丙氨酸扫描进行初步筛选，dock-design虚拟计算点饱和筛选得到两株突变株m1、m2活性分别提高了4.68、5.44倍。使得重组糖基转移酶基能够高效将r’-苯乙醇转化为r’-苯乙醇糖苷。使用蔗糖合酶mcsusy突变体s31d偶联糖基转移酶ugtan85突变体m2经分批补料反应以2-苯乙醇为底物最高可生产45.8g/l苯乙醇糖苷、以酪醇为底物可生产51.49g/l红景天苷。

32、有益效果：

33、本发明糖基转移酶ugtan85酶是一种嗜热、嗜碱、稳定性高且能高效催化r’-苯乙醇生产r’-苯乙醇糖苷的糖基转移酶，相对于大多数植物来源的糖基转移酶，具有耐高温、可持续催化时间长、苯乙醇毒性耐受高等特点。已知浓度介于2-3g/l的2-苯乙醇能够抑制多种细菌和真菌的生长，本发明酶突变体m2可耐受80mm(9.76g/l)的2-苯乙醇并可多次分批补料反应(图9)。本发明酶可在较高温度下进行反应，从而提升催化效率，有助于在短时间内获得大量产物。其突变体ugtan85突变体m1、ugtan85突变体m2相对野生型酶具有更高的酶活，可加快反应进行。