一种鞭式节丛孢液体发酵产生厚垣孢子的方法及其应用

本发明属于动植物寄生线虫病生物防治用真菌培养，具体涉及一种鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）液体发酵产生厚垣孢子的方法及其应用。

背景技术：

1、寄生线虫每年给农业生产和畜牧业造成重大损失。生物防治是防控寄生线虫的有效手段之一。捕食线虫真菌作为植物寄生线虫的天敌，是线虫生物防治的重要资源。目前由捕食线虫真菌开发的线虫生防制剂主要是由菌丝及分生孢子制成，存在不稳定、货架期短的问题。真菌厚垣孢子抗逆性强，内含丰富的内源营养，容易在土壤中定殖，由厚垣孢子制成的生防制剂具有耐储藏、稳定性高、货架期长等优点，可以弥补现有线虫生防制剂的不足。

2、鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）是一种典型的捕食线虫真菌，通过产生三维菌网捕捉线虫。该菌已用于动物寄生线虫的生物防治。现阶段，鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）产生厚垣孢子主要是通过固体培养，专利cn111728085a中公开了一种食线虫真菌 duddingtonia flagrans厚垣孢子营养颗粒制剂的制备方法与应用，该食线虫真菌与 arthrobotrys flagrans为同物异名，该专利中公开了该菌固体培养产生厚垣孢子。由于固体培养时间长、工业化生产成本高，因此通过液体发酵鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）产生厚垣孢子是拟解决的关键技术问题。

3、目前仅有一篇关于该菌液体培养产生厚垣孢子的文献（常凡凡，黄海岩，蔺国珍，刘新宇，赵天宇，李凤迪，蔡葵蒸，食线虫性真菌 duddingtonia flagrans f088的生长和产孢特性，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2021，49(8)，145-154）。

4、该文献中公开了：以 d.flagrans f088分离株为研究对象，研究该菌培养过程中ph值、厚垣孢子产量、菌丝干质量等指标的变化；通过单因素试验及正交试验，研究几种常见碳源、氮源、无机盐、维生素和碳氮比对厚垣孢子产量和菌丝平均生长速率的影响。供试真菌在培养2d后进入对数生长期，4d时达到高峰(od600值为7.46，菌丝干质量为12.07g/l)，而ph快速下降至4.45；3d开始产生厚垣孢子，4d时呈爆发式增长。od600与菌丝干质量、厚垣孢子产量呈极显著正相关，与ph呈极显著负相关。单因素试验结果表明，产生厚垣孢子的最佳碳源为白糖，氮源为大豆蛋白胨，碳氮比为40：1，维生素为vb1、无机盐为mgso4；菌丝生长较好的碳源为红糖，氮源为大豆蛋白胨，与对照相比，无机盐和维生素对菌丝生长无显著促进作用。4因素3水平正交试验结果显示， d.flagrans f088产生厚垣孢子和菌丝生长的最佳配方组合为：30g/l白糖、4g/l大豆蛋白胨、1g/l mgso4和30mg/l vb1。初步明确了 d.flagrans f088培养过程中ph、厚垣孢子产量、菌丝干质量等的变化趋势，确定了该菌菌丝平均生长速率和厚垣孢子产量达到最佳时的营养要素和配方组成。但是该文献中厚垣孢子产量依然不高，且生产周期较长，需要培养8天才能够达到最高产量。因此该方法依然无法满足工业化生产的要求。

技术实现思路

1、本发明为了解决目前还没有一种捕食线虫真菌液体培养大量产生厚垣孢子的培养基，因而无法满足工业化生产要求等问题，提供了一种鞭式节丛孢液体发酵产生厚垣孢子的方法及其应用。

2、本发明由如下技术方案实现的，一种鞭式节丛孢液体发酵产生厚垣孢子的方法，所述鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏地址为中国北京，保藏编号为：cgmcc no.40495；

3、所述鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）在pda培养基上培养活化，然后接种于pdb培养基中培养成液体种子，液体种子接种于液体发酵培养基中发酵72-96h，获得富集大量厚垣孢子的发酵液；其中：液体发酵培养基为：10-30g/l葡萄糖或蔗糖、0.1-30g/lnano3、0.5g/l mgso4、0.01g/l feso4、0.5g/l kcl、1.0g/l k2hpo4。

4、进一步的，液体发酵培养基为：10g/l葡萄糖、3g/l nano3、0.5g/l mgso4、0.01g/lfeso4、0.5g/l kcl、1.0g/l k2hpo4。

5、具体方法为：

6、（1）活化菌种：鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）菌块接种于pda固体培养基上，28℃恒温培养5天至菌丝长满培养基，活化菌种；

7、（2）制备液体种子：收集步骤（1）所得活化菌种的菌丝，将其接种于pdb培养基中，28℃、180 rpm恒温摇床培养2-3天得到液体种子；

8、（3）发酵产生厚垣孢子：以液体发酵培养基的体积为计算基准，步骤（2）所制备的液体种子按体积比为10%-30％的接种量接入液体发酵培养基中，于28℃、80-150 rpm的恒温摇床中培养72-96h得到富集厚垣孢子的发酵液。

9、步骤（1）中将长满菌丝的鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）菌块接种于含有pda培养基的培养皿中。

10、步骤（2）中活化的菌丝接种于pdb培养基中。

11、进一步的，步骤（3）中液体种子按体积比为15％的接种量接入液体发酵培养基中。

12、本发明还提供了所述方法获得的鞭式节丛孢厚垣孢子在动植物寄生线虫防治中的应用。

13、本发明中，鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）从土壤中自行采集分离得到，经鉴定为鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans），该菌株在液体发酵中快速大量生产厚垣孢子。该方法生产的鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）厚垣孢子能够用于动植物寄生线虫的防治。相比于传统的固体发酵法制备厚垣孢子，本发明的厚垣孢子液体制备方法具有产量高、耗时短、成本低的优点。本发明制备的厚垣孢子可以应用于动植物寄生线虫的生物防治，为延长线虫生物防治剂的货架期奠定坚实的基础。

14、本发明所述方法可以显著缩短鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）发酵产厚垣孢子的生产周期，大幅度增加厚垣孢子的产率，从而降低厚垣孢子的生产成本。该方法在液体条件下即可产生大量厚垣孢子，能够用于寄生线虫的生物防治，具有很大的实用价值。

15、本发明所述菌株：鞭式节丛孢（ arthrobotrys flagrans）于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏编号为：cgmcc no.40495。