一种抑制二化螟解毒代谢活性的dsRNA、基因片段及引物对和应用

本发明属于农业生物，具体而言，涉及一种抑制二化螟解毒代谢活性的dsrna、基因片段及引物对和应用。

背景技术：

1、水稻是人类赖以生存的重要粮食作物，是保证我国粮食安全的关键。然而水稻的整个生长季均易遭受虫害威胁，其中二化螟chilo suppressalis发生严重。二化螟属于鳞翅目草螟科，具有超强的繁殖力及越冬能力，在我国长江以南水稻产区皆有分布。二化螟主要通过钻蛀方式取食危害，在苗期可造成水稻枯鞘、枯心和虫伤株，在孕穗期和抽穗期可造成枯孕穗和白穗等，致使水稻减产50％甚至100％，严重威胁我国水稻的安全生产。化学杀虫剂具有见效快、效果显著、使用方便且不受地区和季节限制等优势。因此，施用双酰胺类化学杀虫剂是目前我国防治二化螟的主要措施。但长期不合理使用导致二化螟抗药性不断提高，田间防效显著下降，促进了二化螟的猖獗危害，造成恶性循环。rnai是一种由dsrna特异性地引起同源基因沉默的现象，由于该技术可针对害虫特异靶点设计dsrna序列，具有高度的特异性，并且dsrna在大田环境中不稳定，残留风险低，不会对人类和生态环境造成危害，因而受到害虫防治工作者的广泛关注。

2、谷胱甘肽s-转移酶(glutathione s-transferases,gsts,ec 2.5.1.18)是一个多功能的超家族解毒酶系，广泛分布于生物体内。根据gsts在细胞中的位置不同可分为线粒体gsts(mitochondrial gsts)、微粒体gsts(microsomal gsts,mgsts)和胞质gsts(cytosolic gsts)三大类。mgsts是一类膜蛋白，目前已被归类为参与花生四烯酸和谷胱甘肽代谢的膜相关蛋白超家族中。

3、rnai技术是利用dsrna在dicer酶作用下形成众多小的rna片段，最终引起靶向mrna发生降解，导致细胞或个体不能合成相应的氨基酸，引起个体功能表现缺失，达到干扰敲除的目的。已有研究证实，rnai技术在二化螟防治中具有很好的应用前景。

4、因此推测对二化螟中mgsts基因进行rnai，可有效抑制二化螟对化学药剂的解毒代谢活性，但以所述mgsts基因为靶标的dsrna、干扰基因片段及引物对和相关用途仍不明确。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种以二化螟mgsts基因为靶标的dsrna、干扰基因片段及引物对和应用，dsrna抑制mgsts基因表达影响二化螟生长发育及化蛹，抑制二化螟对化学药剂的解毒代谢活性，提高化学药剂氯虫苯甲酰胺对二化螟的致死作用，抑制二化螟的种群增长，降低了二化螟幼虫对常用化学药剂氯虫苯甲酰胺的抗药性，延长杀虫剂的使用寿命，为植物抗虫基因工程提供重要靶标，也为解决二化螟抗药性问题及二化螟防治中新型核酸杀虫剂研发问题提供新思路及技术支撑。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下方案实现：

3、一方面，本发明提供一种mgsts基因或其编码蛋白作为靶标用于制备抑制二化螟生长发育，或降低二化螟对化学药剂抗药性的制剂的用途，所述mgsts基因具有如seq idno.1所示的核苷酸序列；所述编码蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。

4、另一方面，本发明提供一种抑制二化螟解毒代谢活性的基因片段，以mgsts基因或其编码蛋白为靶标经扩增制得。

5、进一步，所述基因片段，具有如seq id no.3或seq id no.8所示的核苷酸序列。

6、优选地，所述基因片段包括如seq id no.8所示的核苷酸序列。

7、再一方面，本发明提供一种用于扩增所述基因片段的引物组，包括上游引物seqid no.4和下游引物seq id no.5，或包括上游引物seq id no.6和下游引物seq id no.7。

8、优选地，所述引物组包括上游引物seq id no.6和下游引物seq id no.7。

9、再一方面，本发明提供一种抑制二化螟解毒代谢活性的dsrna，以所述的基因片段为模板转录制得。

10、进一步，所述的dsrna以基因片段seq id no.3或seq id no.8为模板体外转录合成，制得dsrna1和dsrna2。

11、优选地，所述dsrna包括dsrna2。

12、再一方面，本发明提供一种dsrna用于制备抑制二化螟生长发育，或降低二化螟对化学药剂抗药性的制剂的用途，所述dsrna以所述的基因片段为模板转录制得。

13、进一步，所述dsrna通过抑制二化螟对化学药剂的解毒代谢活性，从而来干扰二化螟生长发育，或降低二化螟对化学药剂抗药性。

14、进一步，所述dsrna通过注射至二化螟幼虫体内来抑制二化螟对化学药剂的解毒代谢活性，注射剂量为1.0μg。

15、再一方面，本发明提供一种引物组用于制备抑制二化螟生长发育，或降低二化螟对化学药剂抗药性的制剂的用途，所述引物组包括上游引物seq id no.4和下游引物seqid no.5，或包括上游引物seq id no.6和下游引物seq id no.7。

16、再一方面，本发明提供一种基因片段用于制备抑制二化螟生长发育，或降低二化螟对化学药剂抗药性的制剂的用途，所述基因片段具有如seq id no.3或seq id no.8所示的核苷酸序列。

17、再一方面，本发明提供一种二化螟的防治方法，采用含有dsrna的制剂处理二化螟，所述dsrna以所述的基因片段为模板转录制得。

18、再一方面，本发明提供一种杀虫剂，含有抑制二化螟解毒代谢活性的dsrna，所述dsrna以所述的基因片段为模板转录制得。

19、再一方面，本发明提供一种抑制二化螟解毒代谢活性的试剂盒，含有抑制二化螟解毒代谢活性的dsrna，所述dsrna以所述的基因片段为模板转录制得。

20、本发明的有益效果为：

21、1、注射dsrna1或dsrna2可以有效降低二化螟幼虫体内mgsts基因mrna的表达，抑制二化螟幼虫的生长发育、降低化蛹率及蛹重；同时，dsrna2的效果更显著。

22、2、注射dsrna1或dsrna2可以有效降低二化螟幼虫体内mgsts基因mrna的表达，抑制二化螟对化学药剂的解毒代谢活性，提高化学药剂氯虫苯甲酰胺对二化螟的致死作用，降低二化螟幼虫对常用化学药剂氯虫苯甲酰胺的抗药性；同时，dsrna2的效果更显著。

23、3、本发明提供的一种mgsts基因作为靶标用于制备抑制二化螟生长发育，或降低二化螟对化学药剂抗药性的制剂的用途，抑制二化螟对化学药剂的解毒代谢活性，提高化学药剂氯虫苯甲酰胺对二化螟的致死作用，抑制二化螟的种群增长，降低了二化螟幼虫对常用化学药剂氯虫苯甲酰胺的抗药性，延长杀虫剂的使用寿命，为植物抗虫基因工程提供重要靶标，也为解决二化螟抗药性问题及二化螟防治中新型核酸杀虫剂研发问题提供新思路及技术支撑。