一种复制型慢病毒检测方法与流程

本发明涉及病毒检测，尤其涉及一种复制型慢病毒检测方法。

背景技术：

1、慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒家族，来源于慢病毒的复制缺陷病毒载体已成功用于介导目的基因在靶向细胞的转移和表达，且能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前慢病毒颗粒作为一种基因载体工具，已广泛应用于临床治疗研究，包括基因和细胞治疗。然而这些病毒颗粒，由于在生产过程中，经过工程化处理，是一种复制缺陷性的慢病毒。

2、目前基因治疗产品所用慢病毒载体均是非复制型的，但在病毒包装过程中，可能会由于同源或非同源重组等机制产生复制型慢病毒(rcl)。rcl同逆转录病毒载体一样可以整合在细胞基因组中，从而产生因整合诱发的激活原癌基因、破坏抑癌基因或使促细胞生长因子表达增高而造成二次肿瘤的风险；此外，因其具有复制性，即可产生具有复制能力的病毒，加之慢病毒载体采用了可感染多种细胞的膜蛋白vsv-g，大大增加了整合而造成二次肿瘤的风险。出于安全、有效、质量可控的考虑，应当对该类病毒进行检测，以避免在人体内无控地自我复制，造成伤害，防止发生临床安全性隐患事件。在2006年，美国颁布了基因治疗产品关于rcl的指导意见，即fda(food and drug administration)rcr guidance，2010年美国fda建议需对以慢病毒为载体的临床细胞和基因治疗产品进行rcl检测。

3、fda推荐的检测方案是基于细胞的检测方案，整个检测方案检测时间超过6周，但是目前很多i/ii期临床试验需要新鲜的细胞产品来给予受试者。显然基于细胞的rcl检测方案无法满足当前的需求，因此急需建立一种周期短的检测方案来替代目前基于细胞的rcl检测方法。

4、目前rcl的检测方法主要包括针对特定基因(如vsv—g基因、psi—gag基因或galv基因)的pcr法或qpcr法以及敏感细胞感染试验法。为了提高试验的灵敏度，fda和nmpa推荐使用以细胞培养为基础的感染性试验进行rcl的检测，该方法首先将可能存在的rcl在敏感细胞上扩增，并在培养终点利用敏感、快速的检测方法进行检测。

5、中国专利公开cn113789345a提供了一种用于检测可复制性慢病毒(rcl)的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括包含所述的重组表达载体puc19-nl4-3hiv-egfp-att或者所述的重组菌nl4-3hiv-egfp-att，所述重组菌nl4-3hiv-egfp-att含有所述的重组表达载体puc19-nl4-3hiv-egfp-att。该发明提出了一种以现有慢病毒载体起源的慢病毒元件为基础的rcl检测方法，并制备了相应的条件可复制性慢病毒弱毒株，试剂盒用于实施细胞治疗产品的rcl检测方法。

6、中国专利公开cn112877475a提供了一种检测rcl的引物探针组合、试剂盒和检测方法，属于病毒检测技术领域，所述引物探针组合包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列为tgcacacttt ctgagaagga gagaca，所述引物对的下游引物的核苷酸序列为caagactaca aacacatgca gtaat，所述探针的核苷酸序列为acattcacct tccatgcaga ta。采用该发明提供的引物探针组合从样品制备到获得检出结果不超过8h，缩短了检测周期，对rcl的检测下限为5拷贝。

7、然而现有方法具有以下问题：使用上述现有的复制型慢病毒检测方法，虽然检测周期缩短，检测下限降低到5至10拷贝，然而，由于这些检测方法存在rcl结构的依赖性，在多次重复测试中，容易出现rcl假阳性或假阴性的问题，导致对样品中rcl的阴阳性的判断存在不合理和误判。

8、此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

1、针对现有技术之不足，本发明提供了一种复制型慢病毒检测方法，包括：

2、将待检测样本在培养细胞上进行连续传代培养，在培养过程中，分别在第一时间点、第二时间点和第三时间点收集培养细胞的沉淀和细胞培养上清液，得到第一待检测样品、第二待检测样品和第三待检测样品；

3、将由第一待检测样品、第二待检测样品和第三待检测样品中的rna反转录得到的互补dna分别与第一探针引物组进行一次荧光定量pcr，以提取t细胞系dna与pvsv-g质粒混合物分别作为一次第一对照、一次第二对照和一次第三对照；

4、基于第一待检测样品的一次循环次数值a1、第二待检测样品的一次循环次数值a2和第三待检测样品的一次循环次数值a3以及一次第一对照的循环次数值a1’、一次第二对照的循环次数值a2’和一次第三对照的循环次数值a3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒。

5、根据一种优选的实施方式，基于第一待检测样品的循环次数值a1、第二待检测样品的循环次数值a2和第三待检测样品的循环次数值a3以及一次第一对照的循环次数值a1’、一次第二对照的循环次数值a2’和一次第三对照的循环次数值a3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒包括：

6、当a1大于a1’，a2大于a2’并且a3大于a3’时，待检测样本是阴性；

7、当a1小于a1’，a2小于a2’并且a3小于a3’时，待检测样本是阳性。

8、本发明通过在三个不同的培养时间点提取第一待检测样品、第二待检测样品和第三待检测样品，分别进行pcr检测并与相应的对照进行循环次数值的比对，只有在三个时间点的待检测样品的循环次数值均小于相应的对照的循环次数值时，才判断待检测样本是rcl阳性，只有在三个时间点的待检测样品的循环次数值均大于相应的对照的循环次数值时，才判断待检测样本是rcl阴性，使得对于样品的rcl阴阳性的检测判断更加准确。

9、根据一种优选的实施方式，基于第一待检测样品的循环次数值a1、第二待检测样品的循环次数值a2和第三待检测样品的循环次数值a3以及一次第一对照的循环次数值a1’、一次第二对照的循环次数值a2’和一次第三对照的循环次数值a3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒包括：

10、当a1大于a1’，a2大于a2’，a3大于a3’，并且a1大于a2，a2大于a3时，待检测样本是阴性；

11、当a1小于a1’，a2小于a2’，a3小于a3’，并且a1大于a2，a2大于a3时，待检测样本是阳性。

12、通过该方法，进一步考虑了三个时间点提取的待检测样品之间的循环次数值的关系，只有第一待检测样品的循环次数值大于第二待检测样品的循环次数值，并且第二待检测样品的循环次数值大于第三待检测样品的循环次数值时，并且在三个时间点的待检测样品的循环次数值均小于相应的对照的循环次数值时，才判断待检测样本是rcl阳性。只有第一待检测样品的循环次数值大于第二待检测样品的循环次数值，并且第二待检测样品的循环次数值大于第三待检测样品的循环次数值时，并且在三个时间点的待检测样品的循环次数值均大于相应的对照的循环次数值时，才判断待检测样本是rcl阴性。这样能够进一步减少误判的发生，提高检测的准确度和可信度。

13、根据一种优选的实施方式，基于第一待检测样品的一次循环次数值a1、第二待检测样品的一次循环次数值a2和第三待检测样品的一次循环次数值a3以及一次第一对照的循环次数值a1’、一次第二对照的循环次数值a2’和一次第三对照的循环次数值a3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒还包括：

14、当a1大于a1’，a2大于a2’并且a3小于a3’，或者

15、当a1大于a1’，a2小于a2’并且a3大于a3’，或者

16、当a1小于a1’，a2大于a2’并且a3大于a3’时，

17、将由第一待检测样品、第二待检测样品和第三待检测样品中的rna反转录得到的互补dna分别与第二探针引物组进行二次荧光定量pcr，以提取t细胞系dna与pvsv-g质粒混合物分别作为二次第一对照、二次第二对照和二次第三对照；

18、基于第一待检测样品的二次循环次数值b1、第二待检测样品的二次循环次数值b2和第三待检测样品的二次循环次数值b3以及二次第一对照的循环次数值b1’、二次第二对照的循环次数值b2’和二次第三对照的循环次数值b3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒。

19、根据一种优选的实施方式，基于第一待检测样品的二次循环次数值b1、第二待检测样品的二次循环次数值b2和第三待检测样品的二次循环次数值b3以及二次第一对照的循环次数值b1’、二次第二对照的循环次数值b2’和二次第三对照的循环次数值b3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒包括：

20、当b1大于b1’，b2大于b2’并且b3大于b3’时，待检测样本是阴性；

21、当b1小于b1’，b2小于b2’并且b3小于b3’时，待检测样本是阳性。

22、通过这种方式，在一次荧光定量pcr无法确定待检测样本的rcl阴阳性的上述情况下，采用第二引物探针组进行二次荧光定量pcr，只有二次荧光定量pcr中，第一待检测样品的二次循环次数值、第二待检测样品的二次循环次数值和第三待检测样品的二次循环次数值均大于对应的对照的循环次数值时，才确定待检测样本是rcl阴性，反之，才判定待检测样本是rcl阳性。通过两种引物探针组的检测结果综合判断，显著降低了上述情况中rcl假阳性或假阴性的问题。

23、根据一种优选的实施方式，基于第一待检测样品的一次循环次数值a1、第二待检测样品的一次循环次数值a2和第三待检测样品的一次循环次数值a3以及一次第一对照的循环次数值a1’、一次第二对照的循环次数值a2’和一次第三对照的循环次数值a3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒还包括：

24、当a1小于a1’，a2小于a2’并且a3大于a3’，或者

25、当a1小于a1’，a2大于a2’并且a3小于a3’，或者

26、当a1大于a1’，a2小于a2’并且a3小于a3’时，

27、将由第一待检测样品、第二待检测样品和第三待检测样品中的rna反转录得到的互补dna分别与第三探针引物组进行三次荧光定量pcr，以jurkat细胞的互补dna分别作为三次第一对照、三次第二对照和三次第三对照；

28、基于第一待检测样品的三次循环次数值c1、第二待检测样品的三次循环次数值c2和第三待检测样品的三次循环次数值c3以及三次第一对照的循环次数值c1’、三次第二对照的循环次数值c2’和三次第三对照的循环次数值c3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒。

29、根据一种优选的实施方式，基于第一待检测样品的三次循环次数值c1、第二待检测样品的三次循环次数值c2和第三待检测样品的三次循环次数值c3以及三次第一对照的循环次数值c1’、三次第二对照的循环次数值c2’和三次第三对照的循环次数值c3’各自的分析比对确定待检测样本是否含有复制型慢病毒包括：

30、当c1大于c1’，c2大于c2’并且c3大于c3’时，待检测样本是阴性；

31、当c1小于c1’，c2小于c2’并且c3小于c3’时，待检测样本是阳性。

32、通过这种方式，在一次荧光定量pcr无法确定待检测样本的rcl阴阳性的上述情况下，采用第三引物探针组进行三次荧光定量pcr，只有三次荧光定量pcr中，第一待检测样品的三次循环次数值、第二待检测样品的三次循环次数值和第三待检测样品的三次循环次数值均大于对应的对照的循环次数值时，才确定待检测样本是rcl阴性，反之，才判定待检测样本是rcl阳性。通过两种引物探针组的检测结果综合判断，显著降低了上述情况中rcl假阳性或假阴性的问题。

33、发明人发现，利用现有的复制型慢病毒检测方法，在利用一种引物探针组对三个时间点的待检测样品的检测无法得到一致的检测结果时，无法仅通过这种这三个时间点的待检测样品与相应对照的循环次数值的对比分析得到准确的rcl阴阳性判断结果。通过与第二引物探针组或第三引物探针组的联合分析，在利用第二引物探针组的二次荧光定量pcr或利用第三引物探针组的三次荧光定量pcr后，在相应的二次荧光定量pcr或三次荧光定量pcr显示出一致的待检测样品和对照的循环次数值的对比结果时，才能准确得到待检测样本中的rcl的阴阳性。根据一次荧光定量pcr的检测结果分别选择一次荧光定量pcr和二次荧光定量pcr的组合方式或者一次荧光定量pcr和三次荧光定量pcr的组合方式是发明人通过多次检测实验数据统计得到的最佳检测方式。

34、需要注意的是，当通过上述方法得到的检测结果无法直接确定待检测样本中的rcl的阴阳性时，例如，二次荧光定量pcr或者三次荧光定量pcr的结果显示待检测样品与对照的循环次数值的比较结果仍然不一致时，将检测结果判定为“不确定”。在这种情况下，仅采用荧光定量pcr方法无法产出足够准确的结果，需要采用其他的检测方法，例如共培养测定法或合胞体形成测定法来确认。

35、根据一种优选的实施方式，第一探针引物组是：上游引物序列为agggaactgtgggatgactg，下游引物序列为gaacacctgagcctttgagc，探针序列为fam-tatgaagacgtggaaattggaccca–mgb。

36、根据一种优选的实施方式，第二探针引物组是：上游引物序列为tgcacactttctgagaaggagagaca，下游引物序列为caagactacaaacacatgcagtaat，探针序列为fam-acattcaccttccatgcagata-mgb。

37、根据一种优选的实施方式，第三探针引物组是上游引物序列为attcaagcagacggttggatgt，下游引物序列为ccataccagcggaaatcaca，探针序列为fam-catgcttccaaatgggtcacta-mgb。

38、需要说明的是，以上三个探针引物组是发明人通过现有技术获得。然后，当仅仅单独使用其中一个探针引物组进行复制型慢病毒的检测时，虽然预期具有85％以上，甚至90％以上的检测准确率，但实际检测时往往达不到。通常而言，根据发明人进行的独立重复实验的结果，当单独使用一个探针引物组时，上述第一探针引物组和第二探针引物组能达到约70％的准确率，第三探针引物组能达到约75％左右的准确率。这样的检测准确率对于需要进行产业化实施的检测方法而言是远远不够的。并且，当使用上述探针引物组单独进行检测时，也时常会出现相同的探针引物组对于同一样品进行的两次检测，检测结果不一致，或者两个探针引物组对于统一样品的检测结果不一致的情况，这均极大地降低了以上检测方法的可信度。当发明人考虑将以上探针引物组进行组合检测时，一方面延长了检测花费的时间周期，另一方面，如何组合使用，当两者或三者检测结果不一致时如何处理，这些问题均使得组合使用这一解决方案无法执行。

39、出乎意料地，发明人发现，当依照时序采取特定的组合检测方式，根据首次检测结果的循环次数值，以及不同时间段采集的样品的循环次数值的相互关系选择下一次检测所使用的探针引物组进行组合检测时，检测结果的准确性能够得到实质的提升。通过反复实验验证，发明人发现，本发明提供的检测方法能够实现95％以上的检测准确率，并显著降低了单独检测时假阳性或假阴性的问题。当使用其他的组合检测方式时，例如，首次检测使用第二或第三探针引物组，或者在首次检测出现对应的检测结果后，更换第二或第三探针引物组的组合方式，均没有观察到得到显著提高的检测结果。

40、根据一种优选的实施方式，第一时间点是培养后24小时，第二时间点是培养后36小时，第三时间点是培养后48小时。根据另一种优选的实施方式，第一时间点是培养后24小时，第二时间点是培养后48小时，第三时间点是培养后72小时。