一种用于检测子宫内膜胚胎种植窗偏移状态的基因标志物组合及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种用于检测子宫内膜胚胎种植窗(woi)偏移状态的基因标志物组合及其应用。

背景技术：

1、辅助生殖治疗(art)，尤其是体外受精-胚胎移植(ivf-et)技术，是当前公认的治疗不孕不育的有效手段。但数据显示，当前采用传统ivf-et方案进行胚胎移植的成功率仅40％左右，且有相当部分的患者经历反复种植失败(recurrent implantation failure,rif)即经历3次以上的胚胎种植，仍未实现临床妊娠。

2、研究发现，约2/3的失败案例由错误判断患者的胚胎种植窗(woi)导致。传统认知中，女性子宫内膜的woi在月经周期第19-21天开放，然而反复移植失败或罹患继发性不孕症的女性，其woi的时间节点往往会发生前移或后移，如按照传统胚胎植入方案，即在自然周期lh+7天或人工周期p+5天实施ivf-et，存在胚胎移植失败的风险。因此，发明能够准确判断子宫内膜woi是否偏移的检测方法对生殖障碍患者的诊治具有重要意义。

3、目前，临床采用组织形态学检测、超声检测、分子标志物检测等方法可以大致定位患者woi，但这些技术方法无法准确判断woi偏移状态，且技术理论上也存在一定争议。组织形态学检测，以胞饮突作为标志物，缺点包括：①有创检测，会对子宫内膜造成一定损伤；②业界对胞饮突是否可以作为植入标志物尚存争议；③依赖病理专家经验判断，主观解读，缺乏客观性；④结果的可重复性差，且该检测不能在当周期进行移植，预后价值有限。超声影像学检测，标志物包括子宫内膜厚度、回声类型、膜下血流等，缺点是缺乏统一判别标准，单项参数对er评估的意义均不显著且存争议，须联合多个参数综合评价，可靠性、稳定性不佳。分子标志物检测，标志物包括细胞因子、同源框基因等，缺点是以单一分子标志物作为评估标准存在重复性差、变异性大等局限性。

4、因此，面对反复种植失败这一生殖医学难题和越来越严峻的不孕不育发病形势，研究人员迫切需要找到一种准确判断子宫内膜woi偏移状态的技术方法，能够帮助患者及时调整woi，对于提升ivf-et的成功率和改善不孕患者妊娠结局意义重大。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术无法准确判断拟行ivf-et女性的子宫内膜胚胎种植窗(woi)是否发生时间偏移，难以帮助临床医生确定传统胚胎种植窗(自然周期lh+7天或人工周期p+5天)是否适于胚胎移植的技术问题，提供一种用于检测子宫内膜胚胎种植窗(window of implantation,woi)偏移状态的基因标志物组合或核酸组合物，为不孕不育患者(主要是rif患者)提升ivf-et的成功率和改善不孕患者妊娠结局。

2、本发明的另一目的是提供一种所述基因标志物组合或核酸组合物在用于制备检测子宫内膜woi偏移状态的检测体系产品中的应用。

3、为解决上述问题，本发明提供一种用于检测子宫内膜胚胎种植窗偏移状态的基因标志物组合，所述基因标志物组合为seq id no.1～seq id no.10所示的子宫内膜woi偏移相关特征基因序列。

4、其中，具体基因标志物组合如表1所示。

5、表1 10个与子宫内膜胚胎种植窗口偏移相关特征基因组合

6、

7、本发明提供一种核酸组合物，包含多个多核苷酸或其片段的组合产品，所述多个多核苷酸在黄体期子宫内膜会出现不同程度的差异表达，该多个多核苷酸的序列为seq idno.1～seq id no.10所示的子宫内膜woi偏移相关特征基因序列。

8、所述seq id no.1～seq id no.6所示的6个特征基因序列(dpp4、cxcr1、cxcr2、osm、lcn2、tnfrsf10c)在woi前移组样本中相对上调，在woi后移组样本中相对下调。

9、所述seq id no.7～seq id no.10所示的4个特征基因序列(tm4sf4、ces4a、lrrc1、slc25a48)在woi前移组样本中相对下调，在woi后移组样本中相对上调。

10、本发明还提供了所述基因标志物组合或所述核酸组合物在用于制备检测子宫内膜woi偏移状态的产品中的应用。

11、优选的，所述检测子宫内膜woi偏移状态的产品包括：用rna测序(rna-seq)、基因芯片(microarray)、实时定量pcr(qrt-pcr)对子宫内膜woi偏移状态进行检测评估的产品。

12、所述用rna测序检测子宫内膜woi偏移状态的产品包含seq id no.1～seq idno.10所示子宫内膜woi偏移状态相关特征基因序列的信使rna序列以及对应的检测引物和/或探针。

13、所述用基因芯片检测子宫内膜woi偏移状态的产品包含seq id no.1～seq idno.10所示子宫内膜woi偏移状态相关特征基因序列的杂交探针。

14、所述用实时定量pcr检测子宫内膜woi偏移状态的产品包含特异扩增seq id no.1～seq id no.10所示子宫内膜woi偏移状态相关特征基因序列的信使rna序列以及对应的检测引物和/或探针。

15、本发明还提供一种用于子宫内膜woi偏移状态检测的试剂盒，该试剂盒包含特异性针对seq id no.1～seq id no.10所示子宫内膜woi偏移相关特征基因序列的信使rna序列以及对应的检测引物和/或探针。

16、所述试剂盒在使用时，首先基于子宫内膜细胞中seq id no.1～seq id no.10所示子宫内膜woi偏移相关特征基因序列的表达量数据，结合svm、random forest、knn算法构建预测模型，然后采用所述试剂盒检测受检者活检样本细胞中所述特征基因序列的表达量数据，利用所述预测模型进行分析，确定受检者子宫内膜woi是否存在时间偏移，分类为woi正常、woi前移和woi后移。

17、本发明所述用于检测子宫内膜胚胎种植窗(window of implantation,woi)偏移状态的基因标志物组合，具有以下优点：

18、1)本发明所述用于检测子宫内膜胚胎种植窗(window of implantation,woi)偏移状态的基因标志物组合，为seq id no.1～seq id no.10所示的10个特征基因序列，可以作为准确判断子宫内膜胚胎种植窗口偏移状态的分子学方法，为不孕不育患者(主要是rif患者)提升ivf-et的成功率和改善不孕患者妊娠结局。

19、2)本发明主要基于分子生物学技术和转录组分析方法来实现对子宫内膜woi偏移状态的准确判断，其特征基因标志物敏感度高、特异度强，预测准确度为87.5％。

20、3)利用本发明的试剂盒，可以检测受检者活检样本细胞中seq id no.1～seq idno.10所示子宫内膜woi偏移相关特征基因序列的表达情况，利用预测模型对样本的特征基因表达数据进行分析，准确、客观地判定受检者子宫内膜woi偏移状态，为临床医生提供最佳的胚胎植入建议，以便提高ivf-et的成功率。

21、4)本发明可以对同一患者同一月经周期内多个时间点采集的子宫内膜样本进行特征基因表达数据分析，使准确性大大提高，具有广阔的应用前景。