一种评估肝癌患者术后无复发生存风险的转移相关基因预后模型及微阵列芯片试剂盒

本发明属于诊断试剂，具体涉及一种评估肝癌患者术后无复发生存风险的转移相关基因预后模型及其构建与验证方法、以及包括该转移相关基因预后模型的微阵列芯片试剂盒。

背景技术：

1、几十年来，肝癌的死亡率增长最快，5年生存率为20％，在所有癌症中排名第二。我国国家癌症中心的统计结果显示，肝癌的发病率位列癌症第4位，同时是第5大肿瘤相关致死原因。肝细胞癌(hcc)是最常见的肝癌病理类型，占所有病例的75-85％。晚期诊断和术后高频复发是肝细胞癌患者预后不良的主要原因，但目前临床上已有的预后评价指标如甲胎蛋白水平、tnm分期等不能满足全面反映免疫治疗疗效和准确判断患者生存风险的要求。因此，构建新的基于分子层面的预后预测模型将肝细胞癌患者进行风险分层，对改善患者术后生存，实现肝癌精准治疗具有重要的临床意义。

2、随着技术的进步，我们对与肝癌发生相关的基因改变的理解也在提高。基因组分析描述了几个与hcc病因相关的特征性基因组事件，包括fgf19基因扩增和ctnnb1和tp53基因突变。在分子水平上全面了解hcc发病机制和进展将有助于我们确定核心致癌事件以开发新的治疗策略，但目前仍未满足需求。尽管最佳的临床管理提高了hcc患者的生存率，但术后复发的高频率和转移的存在限制了长期结果。在目前的临床实践中，大多数hcc患者的复发风险是不可预测的。微血管侵犯(mvi)被认为是hcc血行转移的初始阶段，是影响hcc肝切除术后复发和预后的重要危险因素。然而，hcc血管侵犯的遗传机制，尤其是原发肿瘤和门静脉癌栓(pvtt)之间的克隆进化，仍然知之甚少。因此，需要基于新兴高通量技术的全面基因组分析和与疾病复发高度相关的基于基因的预测模型，以增强对hcc进展的分子理解并促进hcc的个体化治疗。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种评估肝细胞癌患者术后复发生存风险，并预测患者对化疗和免疫治疗反应的转移相关基因预后模型及微阵列芯片试剂盒，确定了一种经肿瘤组织检测、可准确评估预后不良风险和肿瘤治疗疗效的分子标记物。用于肝细胞癌患者术后复发生存风险的评估，对高风险患者进行重点监测和治疗干预，提高存活时间；用于评估肝细胞癌个体肿瘤治疗疗效，指导肝癌治疗管理。

2、为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：

3、第一个方面，本发明提供一种评估肝癌患者术后无复发生存风险的转移相关基因预后模型，所述核酸所述转移相关基因预后模型包括11个转移相关基因，以每个基因表达水平经相应系数加权后的总和作为风险评分，以判断患者术后复发生存风险、并预测患者对化疗和免疫治疗反应；所述11个转移相关基因分别为mcm10基因、znf207基因、ckap5基因、exosc5基因、ankrd53基因、mmp1基因、dcun1d4基因、ntf3基因、cd1c基因、gpm6a基因和slamf7基因。

4、优选地，所述11个转移相关基因分别为：

5、mcm10基因的扩增引物序列正义链为tcaaggaactgatggacctgcc，扩增引物序列反义链为ctccaacatccgctgct tctgt；

6、znf207基因的扩增引物序列正义链为ggttgggaaagtgagggattt，扩增引物序列反义链为tcttcttcttgcgacccataac；

7、ckap5基因的扩增引物序列正义链为cacccactaaagcaacttctaaac，扩增引物序列反义链为gggttctgtactgctggaaata；

8、exosc5基因的扩增引物序列正义链为ctgatcaggaacacgtgcga，扩增引物序列反义链为gcagcgattcccggtagaaa；

9、ankrd53基因的扩增引物序列正义链为ggagcacaactacctgattga，扩增引物序列反义链为cttggtattggagaccagagag；

10、mmp1基因的扩增引物序列正义链为cagaaagagacaggagacatgag，扩增引物序列反义链为gaagagtta tcccttgcctatcc；

11、dcun1d4基因的扩增引物序列正义链为cagtggtgcaatgtcctagag，扩增引物序列反义链为cactccacaaactcgtccaa；

12、ntf3基因的扩增引物序列正义链为cgacaacagagacgctacaa，扩增引物序列反义链为cacgtaatcctccatgagatacaa；

13、cd1c基因的扩增引物序列正义链为gcagctacttgagtctttcatttc，扩增引物序列反义链为ttgtgtttcactgagcctatca；

14、gpm6a基因的扩增引物序列正义链为gtgctttgtagcaggcattac，扩增引物序列反义链为gcaagcactctgttctacatttc；以及

15、slamf7基因的扩增引物序列正义链为tgggtctgcagagcaataag，扩增引物序列反义链为cagggccttccaggtataaat。

16、第二个方面，本发明还提供一种评估肝癌患者术后无复发生存风险的转移相关基因预后模型的构建与验证方法，其特征在于，包括如下步骤：

17、步骤(1)，对肝细胞癌肿瘤组织及癌旁组织、门静脉癌栓(pvtt)和循环肿瘤dna(ctdna)进行全外显子组测序；

18、步骤(2)，对步骤(1)得到的全外显子组测序数据利用mutsigcv算法筛选肝癌转移复发高频突变基因；

19、步骤(3)，采用癌症基因组图谱(tcga)数据库的lihc队列作为训练集，中山医院肝癌研究所(lci)的基因表达综合数据库(geo)的gse14520队列和pcr队列作为验证集，步骤(2)筛选出的肝癌转移复发高频突变基因与所述两个数据库中的重叠基因被鉴定为转移相关基因；

20、步骤(4)，在训练集中对所述转移相关基因进行单因素cox回归分析，以筛选与无复发生存显著相关的转移相关基因；采用lasso cox回归分析来确定纳入预后模型的基因及其系数，从而构建预后模型；计算每位患者的风险评分并根据中位数将其分为高风险评分组和低风险评分组，比较两组患者术后无复发生存时间、化疗和免疫治疗反应有无统计学差异；

21、步骤(5)，在验证集中检验上述构建的转移相关基因预后模型：用相同的计算公式计算每个样本的模型风险评分，并将患者分为高风险评分组和低风险评分组，分析两组患者术后无复发生存时间、化疗和免疫治疗反应有无统计学差异。

22、优选地，所述转移相关基因分别为mcm10基因、znf207基因、ckap5基因、exosc5基因、ankrd53基因、mmp1基因、dcun1d4基因、ntf3基因、cd1c基因、gpm6a基因和slamf7基因。

23、优选地，步骤(3)中，风险评分计算公式为其中x和c分别表示特定基因的表达水平和相应的系数，采用lassocox回归分析来确定纳入预后模型的基因及其系数，计算每位患者的风险评分并根据中位数将其分为高风险评分组和低风险评分组。

24、优选地，预后模型计算出的低风险评分的肝细胞癌患者术后无复发生存时间更长，且对化疗和免疫治疗更敏感。

25、第三方面，本发明还提供如上所述的一种评估肝癌患者术后无复发生存风险的转移相关基因预后模型在制备预测肝癌预后的微阵列芯片试剂盒中的应用。

26、第四方面，本发明还提供一种用于预测肝癌预后的微阵列芯片试剂盒，所述微阵列芯片试剂盒包括如上所述的转移相关基因预后模型，所述转移相关基因预后模型包括11个转移相关基因，所述11个转移相关基因分别为mcm10基因、znf207基因、ckap5基因、exosc5基因、ankrd53基因、mmp1基因、dcun1d4基因、ntf3基因、cd1c基因、gpm6a基因和slamf7基因。

27、优选地，所述微阵列芯片试剂盒还包括反转录系统、扩增系统和96微孔板系统；所述反转录系统包括depc水、脱氧核糖核酸混合物和cdna合成混合物；所述扩增系统包括depc水、sybr green、脱氧核糖核酸混合物以及11个转移相关基因核苷酸引物。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

29、本发明通过检测肝细胞癌肿瘤组织中11种转移相关基因的表达水平，利用特定的计算公式获得患者的风险评分数值，能够简便、迅速、准确地评估患者术后复发生存风险，并预测患者对化疗和免疫治疗敏感性，而且预测基因均来自外显子测序，在临床实践中帮助医师对患者进行及时的风险分层和治疗策略制定，指导肝细胞癌的个体化治疗。