本发明涉及微生物发酵，特别是一种ω-3多不饱和脂肪酸的生产方法。
背景技术：
1、epa，又称二十碳五烯酸，是一种长链ω-3系列多不饱和脂肪酸，在调节机体生理健康方面具有多种功能作用，如调节血压、血脂和血糖，抗炎和抗氧化活性等，对动脉粥样硬化斑块因子和减肥也有一些潜在的有益作用。由于人体不能自行合成epa，只能从食物中摄取。
2、dpa，又称二十二碳五烯酸，其有两种结构，一种是ω-3dpa，具有调节血脂、软化血管，降低血液粘度，改善视力、促进生长发育和提高人体免疫功能等作用，其调节血脂的功能比有血管清道夫之称的epa还要强很多倍，更适合于血脂偏高的中老年人，同时也是人类母乳中重要的免疫因子，尤其是婴幼儿生长过程中一种必需脂肪酸；另一种是ω-6dpa，研究证明，ω-6dpa在动物体内可反转化为花生四稀酸，而且ω-6dpa衍生的代谢物可调节巨噬细胞功能，缓解实验性结肠炎等炎症疾病，同时也可有效地抑制血管损伤后的血小板活化和血栓形成，起到预防心血管疾病的作用，与dha结合可增强dha抗炎作用和神经保护作用。ω-3dpa和ω-6dpa都有利于改善高胆固醇饮食仓鼠的脂蛋白分布，尤其前者对主动脉功能有更好的作用。
3、dha，又称二十二碳六烯酸，是人体不可或缺的ω-3系列多不饱和脂肪酸，俗称脑黄金，在促进大脑神经发育、改善视力、缓解脑疾病、抗炎、抗癌、提高免疫力、增强脂代谢、维持肠道和心血管健康等方面具有独特的生理功能，尤其对胎婴儿智力和视力发育至关重要。
4、目前深海鱼油是ω-3脂肪酸的主要商业来源，但海洋微藻却是多不饱和脂肪酸的初级生产者，并具有合成ω-3(如dha、epa)的能力，而且藻油没有腥味，胆固醇含量很少。能生产dha/epa的微生物主要有裂壶藻、高山被孢霉、畸雌腐霉、小球藻、三角褐指藻等，其中，裂壶藻生物量大、脂肪酸含量高，是dha(二十二碳六稀酸)的工业化生产菌株，同时也是epa和dpa实现工业化生产的潜力菌株之一。
5、现有技术中已有使用裂壶藻发酵生产dha、epa或dpa的研究，但是现有裂壶藻发酵方法，无法有效地同时提高dha、epa和dpa的含量，如专利cn202111291970.8中公开了一种含epa和dha的裂壶藻油制备方法，其虽然能够增加dha的含量，但是裂壶藻提取物中epa的含量无法有效的进行提升。
6、因此，仍亟需一种能同时提高多种ω-3多不饱和脂肪酸产量的生产方法。
技术实现思路
1、发明概述
2、本发明提供一种ω-3多不饱和脂肪酸的生产方法，用以解决裂壶藻提取物中epa的含量收率低下的问题。
3、一种ω-3多不饱和脂肪酸的生产方法，其包括：
4、(1)取裂壶藻，培养，得到裂壶藻种子液；
5、(2)将步骤(1)所得裂壶藻种子液按30-40％的接种量转种于发酵培养基中进行发酵，发酵条件为：发酵温度25-28℃，发酵ph在5.0-6.0，并且分阶段调控发酵ph和温度，采用分批补料的方式维持发酵中的发酵培养基中残糖浓度在20-40g/l，发酵过程溶氧控制在50％以上，总发酵144-168h，得到ω-3多不饱和脂肪酸，在发酵开始后第20-48h的这一阶段，流加3-10g/l氨基酸。
6、所述方法有利于裂壶藻生长，有利于提高发酵后菌体干重和ω-3多不饱和脂肪酸的含量和产量。
7、发明详述
8、本发明提供一种ω-3多不饱和脂肪酸的生产方法，用以解决裂壶藻提取物中epa的含量收率低下的问题。
9、为实现上述目的，本发明提供了一种ω-3多不饱和脂肪酸的生产方法，包括：
10、(1)取裂壶藻，培养，得到裂壶藻种子液；
11、(2)将步骤(1)所得裂壶藻种子液按30-40％的接种量转种于发酵培养基中进行发酵，发酵条件为：发酵温度25-28℃，发酵ph在5.0-6.0，并且分阶段调控发酵ph和温度，采用分批补料的方式维持发酵中的发酵培养基中残糖浓度在20-40g/l，发酵过程溶氧控制在50％以上，总发酵144-168h，得到ω-3多不饱和脂肪酸，在发酵开始后第20-48h的这一阶段，流加3-10g/l氨基酸。
12、在一些实施例中，所述氨基酸为以下中的至少一种：谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。在一些实施例中，所述氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸至少两种以上。
13、在一些实施例中，所述氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸，谷氨酸：赖氨酸：酪氨酸的质量比约为1：1：1。
14、在一些实施例中，分阶段调控发酵ph的过程：在发酵过程中的0-48h阶段，控制ph为约5.5-6.0；发酵48h以后控制ph为约5.0-约6.0。
15、在一些实施例中，发酵过程使用酸和/或碱调节ph，所述碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钙中的一种或多种复配；所述酸为柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、草酸、磷酸、硫酸、盐酸、植酸中的一种或是多种复配。
16、在一些实施例中，所述分阶段调控发酵温度的过程：在发酵过程中的0-48h阶段，控制发酵温度为约28℃；发酵48h后发酵温度控制为约25℃。
17、在一些实施例中，所述发酵培养基包括：初始葡萄糖40-60g/l，酵母浸粉5-15g/l，酵母粉2-5g/l，玉米浆干粉2-10g/l，无水硫酸钠10-30g/l，无水氯化钙0.1-0.2g/l，氯化钾0.3-0.6g/l，硫酸镁0.4-0.8g/l，磷酸二氢钾0.5-1.5g/l，硫酸铵0.5-1.5g/l，维生素b1215-40 mg/l，维生素b15-15 mg/l，生物素5-15mg/l。
18、在一些实施例中，步骤(1)中，裂壶藻经过摇瓶培养、一级种子培养、二级种子逐级培养得到所述裂壶藻种子液，
19、其中，
20、所述摇瓶培养包括：将裂壶藻接种于摇瓶种子培养基中进行培养，得到摇瓶种子液，所述摇瓶培养的培养条件：培养温度28-30℃，于180-220rpm摇瓶培养24-30h；
21、一级种子培养包括：将摇瓶种子液按照接种量为2-4％接种于一级种子培养基进行培养，得到一级种子液；一级种子培养的培养条件：培养温度28-30℃，用碱和/或酸调节发酵ph在约5.0-约6.0；
22、二级种子培养包括：在一级种子培养步骤培养至一级种子培养基残糖低于20g/l后按照接种量为10-20％将一级种子液接种于二级种子培养基进行培养，得到裂壶藻种子液；二级种子培养的培养条件：培养温度28-30℃，用碱和/或酸调节发酵ph在5.0-6.0，二级种子培养至二级种子培养基中残糖低于20g/l。
23、在一些实施例中，所述摇瓶种子培养基包括：葡萄糖40-80g/l，酵母浸粉10-15g/l，无水硫酸钠10-15g/l，无水氯化钙0.1-0.2g/l，氯化钾0.3-0.6g/l，磷酸二氢钾0.5-1.5g/l，硫酸铵2.0-4.0g/l，硫酸锌1.0-4.0g/l，硫酸镁2.0-6.0g/l，硫酸钾0.5-1.5g/l；
24、一级种子培养基包括：葡萄糖40-80g/l，酵母浸粉5-15g/l，无水硫酸钠10-15g/l，无水氯化钙0.1-0.2g/l，氯化钾0.3-0.6g/l，磷酸二氢钾0.5-1.5g/l，硫酸铵2.0-4.0g/l，硫酸锌1.0-4.0g/l，硫酸镁2.0-6.0g/l，硫酸钾0.5-1.5g/l；
25、二级种子培养基包括：葡萄糖40-60g/l，酵母浸粉5-15g/l，酵母粉5-10g/l，无水硫酸钠10-20g/l，无水氯化钙0.1-0.2g/l，氯化钾0.3-0.6g/l，磷酸二氢钾0.5-1.5g/l，硫酸铵2.0-4.0g/l，硫酸锌1.0-4.0g/l，硫酸镁2.0-6.0g/l，硫酸钾0.5-1.5g/l。
26、在一些实施例中，所述分批补料为补加葡萄糖。
27、在一些实施例中，所述ω-3多不饱和脂肪酸包括二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸的至少一种。
28、上述的某一技术方案具有以下有益效果：
29、本发明中，在发酵20-48h范围内流加复合氨基酸，有助于裂壶藻生长，菌体干重达到150g/l以上，提高dha和epa的含量，菌体干重中epa的含量可达8％以上，同时在发酵过程中，配合发酵ph由5.5-6.0调节为5.0-6.0，发酵温度由28℃调节为25℃，三种培养条件相互协同作用，可以使得发酵液菌体中，epa的含量达到15％以上。
30、术语说明
31、需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
32、本发明中“室温”、“常温”指的是环境温度，温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”或“常温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另一些实施例中，“室温”或“常温”指的是温度由大约25℃到大约30℃；在又一些实施例中，“室温”或“常温”指的是10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等。
33、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
34、“接种量”是指移入种子液的体积和接种后培养基体积的比例。
35、“g/l”是相对于培养基或发酵罐中液体的的体积而言，例如培养基中葡萄糖40-80g/l是指每升培养基中含葡萄糖40-80g。
36、本发明公开的所有数值均为近似值，无论是否与之关联使用词语“约/大约”或“近似”。它们可能相差1％、2％、5％，或有时甚至相差10％至20％。每当公开具有下限rl和上限ru的数值范围时，则视为具体公开落入所述范围内的任何数值。具体而言，具体公开了所述范围内的下列数值：r＝rl+k*(ru-rl)，其中k是变量，变化范围从1％至100％，增量为1％，即k为1％、2％、3％、4％、5％、...、50％、51％、52％、...、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。此外，还具体公开了由上述定义的两个r数字所定义的任何数值范围。