用于肿瘤浸润淋巴细胞扩增的工程化人工抗原呈递细胞的制作方法

公开了用于扩增肿瘤浸润淋巴细胞的工程化人工抗原呈递细胞(aapc)。

背景技术：

1、使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞(til)治疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。参见gattinoni等，nat. rev.immunol.2006，6，383-393。成功的免疫疗法需要大量的til，商业化需要稳健可靠的方法。由于细胞扩展的技术、物流和监管问题，这是一项挑战。基于il-2的til扩增(随后是“快速扩增方法”(rep))，由于其速度和效率，已成为til扩增的优选方法。参见dudley等，science 2002，298，850-54；dudley等，j.clin.oncol.2005，23，2346-57；dudley等，j.clin.oncol.2008，26，5233-39；riddell等，science 1992，257，238-41；dudiey等，j.immunother.2003，26，332-42。然而，虽然rep可以在14天内导致til扩增1000倍，但它需要通常来自多个供体(如饲养细胞)的大量过量(例如，200倍)的经辐照的同种异体外周血单核细胞(pbmc)，以及抗cd3抗体(okt-3)和高剂量的il-2。参见dudiey等，j.immunother.2003，26，332-42。尽管pbmc具有高性能，但pbmc具有多种缺点，包括需要大量同种异体pbmc、需要从多个健康供体通过白细胞分离术获得pbmc、由此产生的低温储藏后pbmc生存力的供体间差异和易变的til扩增结果、未检测到的病毒病原体导致下游患者感染的风险，以及对每个供体细胞产品进行大量且昂贵的实验室测试以确保无菌和质量(包括病毒污染物测试)和测试扩增特性。

2、不幸的是，与pbmc相比，开发的用于扩增til的aapc具有较差的性能，包括输入的til的表型特性的改变，以及差的扩增性能和/或扩增结果的高度可变性。由于可能适于用作aapc的大量潜在细胞以及识别合适候选物的不可预测性，用于多克隆til的aapc的开发重点迄今为止仅在于成熟的k562细胞系。参见butler和hirano，immunol.rev.2014，257，191-209。例如，在rep前的培养物中(而不在rep培养物中)测试经修饰以表达4-1bbl(cd137l)的k562细胞，以确定肿瘤消化物中til扩增的增强，但是仍然需要将pbmc与k562细胞一起使用以获得til扩增。参见friedman等，j.immunother.2011，34，651-661。其他经修饰以表达cd64、cd86和4-1bbl的工程化k562细胞进行了测试并实现了til扩增，最佳可与pbmc相媲美，并且很可能低于pbmc，并且还遭受了多克隆til表型偏向不太有利的cd8+/cd4+t细胞比率。参见ye等，j.translat.med.2011，9，131。最近，经修饰以表达cd86、4-1bbl(cd137l)、高亲和力fc受体(cd64)和膜结合的il-15的k562细胞也显示出以与pbmc饲养细胞相比相当的数量繁殖til(rep后)，但具有膜结合的il-15的额外复杂性。参见forget等，j.immunother.2014，37，448-60。开发的其他系统缺乏关键的共刺激分子，导致不利的t细胞表型倾斜，或者需要额外的白细胞介素(例如il-21)。参见butler和hirano，immunol.rev.2014，257，191-209。总体而言，尚未显示k562修饰的aapc可提供具有可接受的可变性的til的一致扩增，同时在包括总体扩增细胞计数的其他测量中也比pbmc表现更好。除了k562细胞之外的替代性aapc已经在其他细胞扩增方法中成功，但是没有获得与具有构成til的独特多克隆细胞亚群的pbmc相同的性能。参见maus等，nat.biotechnol.2002，20，143-148；suhoski等，mol.ther.2007，15，981-988。

3、molm-14人白血病细胞系由患有复发性急性单核细胞白血病的患者的外周血建立，并且最初的表型表征表明存在至少以下标志物：cd4、cd9、cd11a、cd13、cd14、cd15、cd32、cd33、cd64、cd65、cd87、cd92、cd93、cd1 16、cd118和cd155。参见matsuo等，leukemia1997，11，1469-77。molm-14的其他表型表征发现更高水平的hla-a/b/c、cd64、cd80、icos-l、cd58和更低水平的cd86。先前未报道molm-14细胞和密切相关的molm-13细胞作为用于肿瘤免疫治疗应用的细胞扩增的有用的aapc。

4、从患有费城染色体阳性cml的患者的骨髓建立em-3人细胞系。参见konopka等，proc.nat’l acad.sci.，美国，1985，82，1810-4。先前尚未报道em-3细胞和密切相关的em-2细胞系作为用于肿瘤免疫治疗应用的细胞扩增的有用的aapc。em-3细胞的表型表征表明存在至少以下标志物：cd13、cd15和cd33。

5、本发明提供了出人意料的发现，用另外的共刺激分子(包括cd86(b7-2)、4-1bbl(cd137l)和ox40l(cd134l))转导工程化骨髓谱系细胞(包括molm-13、molm-14、em-3和em-2细胞)提供了优质和高效的til大量扩展，并具有最低限度的可变性，降低了成本，并且不依赖人类血液样本作为pbmc的来源，具有使用可从主细胞库有效生产的aapc的优点。cd86和4-1bbl是共刺激分子，其为t细胞活化提供共刺激信号。用另外的共刺激分子转导的molm-14、molm-13、em-3和/或em-2细胞可用于例如扩增用于癌症免疫疗法和其他疗法的til。

技术实现思路

1、在一个实施方案中，本发明提供人工抗原呈递细胞(aapc)，其包含用一种以上载体转导的骨髓细胞，其中，一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

2、在一个实施方案中，cd86蛋白和4-1bbl蛋白中的每一种都是人蛋白质。

3、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，aapc可以刺激和扩增与aapc接触的肿瘤浸润淋巴细胞(til)。

4、显而易见的是，在本发明的某些实施方案中，编码cd86的核酸分子可以与编码4-1bbl的核酸分子包含在不同或相同的病毒载体中。

5、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，在包含浓度为约3000iu/ml的il-2和浓度为约30ng/ml的okt-3抗体的细胞培养基中，aapc在7天的时间内将til群扩增至少50倍。

6、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述aapc可以刺激和扩增与aapc接触的t细胞。

7、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述骨髓细胞内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58。

8、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述骨髓细胞基本上不含膜结合的il-15。

9、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述骨髓细胞是molm-14细胞。

10、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述骨髓细胞是molm-13细胞。

11、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述骨髓细胞是em-3细胞。

12、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述骨髓细胞是em-2细胞。

13、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述cd86蛋白包含：seq id no：8所示的氨基酸序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代(conservative amino acidsubstitutions)的氨基酸序列，并且所述4-1bbl蛋白包含：seq id no：9或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的氨基酸序列。

14、在一个实施方案中，本发明提供aapc，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述编码cd86的核酸分子包含seqid no：16所示的核酸序列，所述编码4-1bbl的核酸分子包含seq id no：19所示的核酸序列。

15、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，所述方法包括：使til群与aapc接触的步骤，所述aapc包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，所述til群被扩增。在一个实施方案中，该方法是体外或离体方法。

16、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

17、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

18、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触。

19、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

20、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

21、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

22、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000iu/ml的il-2和初始浓度为约30ng/ml的okt-3抗体。

23、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

24、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

25、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

26、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，在细胞培养基中，apc群在7天的时间内将til群扩增至少50倍。

27、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

28、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

29、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

30、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述骨髓细胞内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58。

31、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

32、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

33、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

34、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述骨髓细胞是molm-14细胞。

35、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

36、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

37、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

38、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述骨髓细胞是molm-13细胞。

39、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

40、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

41、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

42、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述骨髓细胞是em-3细胞。

43、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

44、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

45、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

46、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述骨髓细胞是em-2细胞。

47、在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

48、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

49、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

50、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述cd86蛋白包含：seq id no：8所示的氨基酸序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述4-1bbl蛋白包含：seq id no：9所示的氨基酸序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的氨基酸序列。

51、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

52、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

53、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，所述编码cd86的核酸包含seqid no：16所示的核酸序列，并且所述编码4-1bbl的核酸包含seq id no：19所示的核酸序列。

54、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

55、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

56、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，使用透气性容器进行扩增。

57、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

58、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

59、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，til群与aapc群的比率在1∶200和1∶400之间。

60、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)群的方法，所述方法包括以下步骤：

61、(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aapc)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸分子和编码4-1bbl的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，和

62、(b)在细胞培养基中使til群与aapc群接触，其中，til群与aapc群的比率约为1：300。

63、在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，所述方法包括：使包含til群的til群与骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)接触，其中，所述骨髓aapc包含至少两个与til上的至少两个共刺激分子特异性结合的共刺激配体，其中，共刺激分子与共刺激配体的结合诱导til的增殖，从而特异性地扩增til，并且其中，所述至少两个共刺激配体包含cd86和4-1bbl。在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。

64、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

65、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

66、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

67、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

68、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，并且其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

69、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

70、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，til是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

71、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，并且其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

72、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

73、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

74、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

75、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

76、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-14细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，molm-14细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

77、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(tll)群，其中，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

78、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；

79、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-14细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，molm-14细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

80、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

81、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

82、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

83、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

84、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的em-3细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，em-3细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

85、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

86、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

87、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的em-3细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，em-3细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

88、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

89、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

90、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

91、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

92、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。

93、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

94、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍，其中，骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。

95、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

96、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

97、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

98、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

99、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000iu/ml的il-2和初始浓度为约30ng/ml的okt-3抗体。

100、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(tll)群，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

101、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；并且其中，骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000iu/ml的il-2和初始浓度为约30ng/ml的okt-3抗体。

102、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

103、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

104、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

105、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

106、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，使用透气性容器进行扩增。

107、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(tll)群，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

108、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；并且其中，骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，使用透气性容器进行扩增。

109、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

110、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

111、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

112、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

113、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，第二til群与aapc群的比率在1：200和1：400之间。

114、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

115、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；以及

116、并且其中，骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，第二til群与aapc群的比率在1∶200和1∶400之间。在某些实施方案中，第二til群与aapc群的比率约为1∶300。

117、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

118、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

119、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

120、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

121、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，并且其中，第二til群与aapc群的比率约为1∶300。

122、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

123、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

124、(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；和

125、(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二til群；

126、其中，所述骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。

127、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，til群是第二til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

128、(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群快速扩增第一til群，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二til群的数量比第一til群的数量至少高50倍；以及

129、其中，骨髓aapc内源性表达hla-a/b/c、icos-l和cd58，其中，骨髓aapc被转导以表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。

130、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

131、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

132、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

133、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

134、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群。

135、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

136、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

137、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

138、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

139、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群。

140、其中，所述骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，molm-14细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

141、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

142、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

143、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

144、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

145、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

146、其中，所述骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的em-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，em-3细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

147、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til群是第三til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

148、(a)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含ll-2；

149、(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3。

150、在一个实施方案中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-14细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中molm-14细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。在一个实施方案中，骨髓细胞包含用一种以上病毒载体转导的molm-13细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中molm-13细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。在某些实施方案中，骨髓细胞包含用一种以上病毒载体转导的em-3细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中所述em-3细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。在某些实施方案中，骨髓细胞包含用一种以上病毒载体转导的em-2细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中所述em-2细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

151、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤∶

152、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

153、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

154、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

155、(d)用非清髓性淋巴细胞清除方案治疗患者，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天；

156、(e)将治疗有效份的第三til群施用于患有癌症的患者；和

157、(f)用高剂量il-2方案治疗患者，其中，所述高剂量il-2方案包括：每8小时推注静脉输液600，000或720，000iu/kg的阿地白介素15分钟，直至耐受；

158、其中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，molm-14细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

159、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

160、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

161、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

162、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

163、(d)用非清髓性淋巴细胞清除方案治疗患者，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天；

164、(e)将治疗有效份的第三til群施用于患有癌症的患者；和

165、(f)用高剂量il-2方案治疗患者，其中，所述高剂量il-2方案包括：每8小时推注静脉输液600，000或720，000lu/kg的阿地白介素15分钟，直至耐受；

166、其中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的em-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中，em-3细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

167、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til群是第三til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

168、(a)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含ll-2；和

169、(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

170、进一步地，其中，til群用于与非清髓性淋巴细胞清除方案组合施用于患者，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括：环磷酰胺以60mg/m2/天的剂量施用2天，然后氟达拉滨以25mg/m2/天的剂量施用5天，并且其中，til群与高剂量il-2方案组合施用，其中，高剂量il-2方案包括：每8小时推注静脉输液600，000或720，000iu/kg的阿地白介素15分钟，直至耐受。在某些实施方案中，til群用于在高剂量il-2方案之前和非清髓性淋巴细胞清除方案之后施用。

171、在某些实施方案中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-14细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中molm-14细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的molm-13细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中molm-13细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。在某些实施方案中，骨髓aapc包含用一种以上病毒载体转导的em-3细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码cd86的核酸和编码4-1bbl的核酸，并且其中所述em-3细胞表达cd86蛋白和4-1bbl蛋白。

172、在一个实施方案中，til群用于治疗癌症，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。

173、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

174、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

175、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

176、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；和

177、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

178、其中，在所述第二细胞培养基中，il-2以约3000iu/ml的初始浓度存在，okt-3抗体以约30ng/ml的初始浓度存在。

179、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til群是第三til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

180、(a)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；和

181、(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；其中，在所述第二细胞培养基中，il-2以约3000iu/ml的初始浓度存在，okt-3抗体以约30ng/ml的初始浓度存在。

182、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

183、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

184、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

185、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；和

186、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

187、其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。

188、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(tll)群，其中，til群是第三til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

189、(a)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；和

190、(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。

191、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

192、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

193、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

194、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；和

195、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

196、其中，初始扩增使用透气性容器进行。

197、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

198、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

199、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

200、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；和

201、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

202、其中，快速扩增使用透气性容器进行。

203、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til群是第三til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

204、(a)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

205、(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；其中，初始扩增和/或快速扩增使用透气性容器进行。

206、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

207、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

208、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

209、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

210、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

211、其中，快速扩增中第二til群与aapc群的比率在1：80和1：400之间。

212、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

213、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

214、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

215、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

216、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

217、其中，快速扩增中第二til群与aapc群的比率约为1：300。

218、在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，其中，til群是第三til群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：

219、(a)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第一til群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

220、(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；其中，快速扩增中第二til群与aapc群的比率在1：80和1：400之间。

221、在一个实施方案中，快速扩增中第二til群与aapc群的比率约为1：300。

222、在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：

223、(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；

224、(b)在第一细胞培养基中对第一til群进行初始扩增，获得第二til群，其中，第二til群的数量比第一til群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含il-2；

225、(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群，其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含il-2和okt-3；

226、(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三til群，

227、其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。

228、在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其用于特异性诱导表达已知共刺激分子的肿瘤浸润淋巴细胞的增殖，所述试剂盒包含有效量的aapc，其中，所述aapc包含使用慢病毒载体(lv)转导的molm-14细胞或em-3细胞，其中，lv包含编码至少一种共刺激配体的核酸，所述共刺激配体特异性结合所述已知共刺激分子，其中，已知共刺激分子与所述共刺激配体的结合刺激并扩增所述t细胞，所述试剂盒还包括用于使用所述试剂盒的加样器和说明材料。

229、在一个实施方案中，本发明提供一种评价肿瘤浸润淋巴细胞(til)效力的方法，包括以下步骤：

230、(a)提供多个表达内源性cd16fc受体的小鼠肥大细胞瘤p815细胞，其中，用基于增强型荧光绿色蛋白(gfp)和萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转导p815细胞；

231、(b)在有和没有okt-3的情况下共培养多个p815细胞til，分别评价t细胞受体(tcr)活化(特异性杀伤)或淋巴因子激活杀伤(lak，非特异性杀伤)；

232、(c)孵育4小时；

233、(d)加入荧光素并孵育5分钟；

234、(e)使用光度计读取生物发光强度；和

235、(f)计算细胞毒性百分比和存活率。