治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用的制作方法

本发明涉及基因药物，尤其是涉及治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用。

背景技术：

1、肿瘤在临床上有实体瘤和非实体瘤之分，实体瘤及有形瘤，可通过临床检查如x线摄片、ct扫描，b超、或触诊扪及到的有形肿块称实体瘤，x线、ct扫描，b超及触诊无法看到或扪及到的肿瘤如血液病中的白血病就属于非实体瘤。

2、针对实体肿瘤的主流治疗4种方式：外科手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。这些方法可以移除、毁损、杀伤、破坏肿瘤细胞，使病情缓解。根据肿瘤的种类，可以采用一种治疗方式，或采用多种治疗方式联合治疗。另外肿瘤免疫疗法发展迅速，已逐步发展成为继四种主流肿瘤治疗方式后的另一有效治疗手段；其中因核酸分子的优越特性，基于核酸分子的肿瘤免疫疗法也被提了出来。基于核酸分子的治疗，简单来讲就是利用化学修饰后的核酸分子进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于，提供一种对实体瘤具有治疗效果的核酸分子或核酸分子混合物，该核酸分子或核酸分子混合物含有的多种核酸分子片段能够突破实体瘤的微环境屏障，对肿瘤细胞实现高效的抑制作用。

2、本发明的第二个目的在于，提供由上述核酸分子片段的核酸分子组合物或者融合核酸分子，以不同核酸分子片段的组合物形式，或者以不同核酸分子的融合形式用于治疗实体瘤药物治疗中。

3、本发明的第三个目的在于，提供一种核酸分子药物，所述核酸分子药物包括上述核酸分子组合物和/或融合核酸分子，并将其与适配的载体复合得到能够用于临床的治疗实体瘤的药物。

4、本发明还有一个目的在于，提供上述核酸分子药物的制备方法，通过将含有上述核酸分子的水相与含有载体组分的有机相混合，得到核酸分子药物，该方法简便易行，适合工业化推广。

5、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

6、第一方面，本发明提供治疗性核酸分子或核酸分子混合物，所述核酸分子包括：核酸分子片段(a)，所述核酸分子片段(a)编码il-7蛋白；和，核酸分子片段(b)；所述核酸分子片段(b)编码白细胞介素il-12的p35和p40亚基。

7、本文中核酸或核酸分子指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核酸或核酸分子包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸或核酸分子的实例包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸或核酸分子编码的目的蛋白或多肽可选地为编码正义链或反义链。核酸或核酸分子酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。

8、il-12主要由抗原递呈细胞如树突状细胞和巨噬细胞受到激活所产生。il-12和细胞膜上的il-12受体il-12rb1以及il-12rb2相结合，激活下游的jak2和tyk2，进而诱导stat4磷酸化和二聚化，后者结合目标基因的启动子，调控基因表达，如ifnγ。il-12可以活化nk细胞表达cd69和cd25，促进nk细胞的扩增。il-12可以促进th1细胞的分化和活化，进而活化杀伤性cd8+t细胞。il-12可以促进巨噬细胞向促炎的m1型分化，而不是抗炎的m2型，进而诱导趋化因子cxcl9,cxcl10和cxcl11的表达，促进免疫细胞的招募和富集。

9、il-7在包括淋巴节、骨髓、脾脏、皮肤、肺脏、肝脏等组织都有广泛表达。il-7通过和il-7受体相互作用，激活jak-stat5以及pi3k-akt信号通路，从而调控下游基因的表达。il-7可以提高nk、nkt、lak以及cd8+t细胞的肿瘤杀伤功能。il-7可以通过诱导t细胞和nk细胞表达穿孔素、ifnγ、fasl等增强其对肿瘤的杀伤能力。另外，il-7可以通过刺激单核细胞释放il-1β，il-1α以及tnf-α，抑制肿瘤细胞的生长。il-7可以下调cd8+t细胞上pd-1的表达，从而逆转t细胞衰竭。il-7在维持记忆性t细胞的存活和扩增方面起着重要的作用。另外，在抗原撤回后，il-7可以维持记忆性cd4+和cd8+t细胞池的平衡。

10、细胞因子的生物学功能上存在相互协同作用。il-7可以提高il-12受体在nk细胞和t细胞上的表达，使后者对il-12更敏感。il-7可以协同il-12提高ifn-γ的表达。il-12和il-7可以协同激活t细胞和nk细胞，并提高其对肿瘤细胞的杀伤能力。il-12和il-7协同作用诱导nk细胞表达nkg2e，nkp44，和nkp46，促进nk细胞的成熟。il-12和il-7协同作用诱导抗原递呈细胞表达hla-dr，促进其抗原递呈能力。il-12和il-7协同作用增强t细胞扩增，维持肿瘤浸润淋巴细胞。il-7可以提高肿瘤浸润cd8+t细胞的tcr多样性，而il-12和il-7协同作用，提高少量部分t细胞克隆的比例，从而增强t细胞克隆性。这一协同作用激活肿瘤浸润t细胞并增强抗肿瘤活性。

11、在可选的实施方式中，所述核酸分子还包括核酸分子片段(c)，所述核酸分子片段(c)包括编码如下蛋白的核酸片段：ifn-α、ifn-β、ifn-γ、gm-csf、il-15和il-2中的至少一种，其中所述核酸分子片段(c)编码ifn-α，ifn-α能够提高树突状细胞的抗原递呈能力，并促进其向淋巴结的迁移。ifn-α通过诱导穿孔素和颗粒酶的释放，提高免疫细胞的杀伤能力。ifn-α可以抑制treg和mdsc的免疫抑制性功能和细胞扩增能力。ifn-α可以促进m1型巨噬细胞的分化。此外，ifn-α还可以通过抑制肿瘤细胞的细胞周期、促进细胞终端分化以及诱导细胞凋亡等机制，发挥直接的抗肿瘤作用。

12、在可选的实施方式中，基于细胞因子il-12、il-7和ifn-α的生物学功能以及之间的协同作用，在抗肿瘤治疗领域中，在可选的实施方式中，这三个细胞因子的联合应用，预期达到如下的主要功效：诱导th1细胞的分化和活化，诱导nk细胞的成熟，激活并促进t细胞和nk细胞的扩增，以及对肿瘤的杀伤能力，维持记忆性t细胞的存活和扩增；促进巨噬细胞向促炎的m1型分化，增强树突状细胞的抗原递呈能力，通过诱导趋化因子的表达，促进免疫细胞的招募和向肿瘤组织的浸润；逆转t细胞衰竭，抑制treg和mdsc的功能；直接抑制肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡。

13、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(a)编码的il-7的氨基酸序列如seq idno.42所示，或，包含与seq id no.42至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与seq id no.42至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。

14、在可选的实施方式中，核酸分子片段(a)的核苷酸序列选自：seq id no.22～24和seq id no.47～49中的任意一种。其中，seq id no.22～24为rna序列，seq id no.47～49为dna序列。

15、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(a)的核苷酸序列选自：与seq id no.22～24和seq id no.47～49至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。

16、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(b)编码的il-12的p35亚基的氨基酸序列如seq id no.39所示，或，包含与seq id no.39至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与seq id no.39至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。

17、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(b)编码的il-12的p40亚基的氨基酸序列如seq id no.40所示，或，包含与seq id no.40至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与seq id no.40至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。

18、在可选的实施方式中，核酸分子片段(b)编码的il-12的p35亚基和p40亚基通过氨基酸序列为seq id no.41(gssggggspgggss)所示的linker连接。

19、在可选的实施方式中，核酸分子片段(b)的核苷酸序列选自：seq id no.19～21和seq id no.44～46中的任意一种。其中，seq id no.19～21为rna序列，seq id no.44～46为dna序列。

20、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(b)的核苷酸序列选自：与seq id no.19～21和seq id no.44～46至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。

21、在可选的实施方式中，核酸分子片段(c)编码的ifn-α多肽的氨基酸序列如seq idno.43所示，或，包含与seq id no.43至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与seq id no.43至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。

22、在可选的实施方式中，核酸分子片段(c)的核苷酸序列选自：seq id no.26～28和seq id no.50～52中的任意一种。其中，seq id no.26～28为rna序列，seq id no.50～52为dna序列。

23、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(c)的核苷酸序列选自：与seq id no.26～28和seq id no.50～52至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。

24、在可选的实施方式中，核酸分子片段(a)、核酸分子片段(b)和/或核酸分子片段(c)可以通过序列优化手段优化mrna序列，改善与体内施用后的表达功效相关的特性：例如提高mrna稳定性、增加靶组织中的翻译功效、减少表达的截短蛋白的数量、改善表达的蛋白质的折叠或防止其错误折叠、降低表达产物的毒性、减少由表达产物引起的细胞死亡、增加和/或减少蛋白质聚集，得到改善特性的mrna。序列优化的目的还包括：保持结构和功能完整性的同时优化基于核酸的治疗剂的配制和递送的特征；克服表达的阈值；提高表达率；半衰期和/或蛋白质浓度；优化蛋白质定位；以及避免不利的生物响应如免疫响应和/或降解途径。序列优化手段包括：(1)根据特定器官和/或宿主生物体中的密码子频率进行密码子优化以确保恰当折叠和适当表达；(2)调节g/c含量以增加mrna稳定性或减少二级结构；(3)使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base runs)最小化；(4)定制转录和翻译控制区；(5)减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。

25、两个核苷酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同氨基酸的百分比。

26、术语「％同一性」或类似术语是指，在最佳比对下，待比较序列之间相同核苷酸或氨基酸之百分比。该百分比为纯粹统计学的，且两个序列之间的差异可能为(但不一定)随机分布于待比较序列之整个长度上。两个序列之比较通常藉由在最佳比对之后，相对于片段或「比较窗口」比较改等序列而进行，以鉴别对应序列之局部区。

27、在可选的实施方式中，所述核酸分子包括dna分子和/或rna分子。

28、在可选的实施方式中，所述dna分子包括链状dna分子和/或环状dna分子。

29、在可选的实施方式中，所述rna分子包括mrna或环形rna。

30、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段的5’端和/或3’端具有保护性修饰基团。

31、在可选的实施方式中，所述核酸分子片段为mrna片段，所述mrna片段的5’端修饰基团选自arca、m7g(5"")ppp(5"")(2""omea)pg、m7g(5"")ppp(5"")(2""omeg)pg、m7(3""omeg)(5"")ppp(5"")(2""omeg)pg、m7(3""omeg)(5"")ppp(5"")(2""omea)pg、mcap、dmcap、tmcap或dmcap。

32、在可选的实施方式中，所述mrna片段的3’端保护性修饰基团为poly(a)，所述poly(a)长度为50～200，优选为80～200。

33、在可选的实施方式中，所述mrna片段还含有5’utr；

34、在可选的实施方式中，所述5’utr的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；

35、在可选的实施方式中，所述5’utr包括kozak序列或dnah2 5’utr；

36、在可选的实施方式中，kozak序列的核苷酸序列如seq id.no.16所示；

37、在可选的实施方式中，dnah2 5’utr的核苷酸序列如seq id.no.38所示；

38、在可选的实施方式中，所述mrna片段还含有3’utr；

39、在可选的实施方式中，3’utr序列如seq id.no.1～10所示，seq id.no.1来自肌酸激酶(creatine kinase，ck)，seq id.no.2来自肌红蛋白(myoglobin)，seq id.no.3来自肌动蛋白(α-actin)，seq id.no.4来自白蛋白(albumin)，seq id.no.5和7来自组胺球蛋白(a-globin)，seq id.no.6来自胶原蛋白(col6a2；collagen,type iv,alpha 2)，seqid.no.10来自血红蛋白hba2。

40、在可选的实施方式中，mrna由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’utr、orf、3’utr和3’poly(a)尾端。

41、在可选的实施方式中，基于提供的rna序列，本领域普通技术人员将能得到相应的dna序列(例如尿嘧啶转换为胸腺嘧啶)。同样地，基于所提供的dna序列，本领域普通技术人员将得到相应的rna序列(例如胸腺嘧啶转换为尿嘧啶)。在可选的实施方式中，基于提供的rna或dna序列，本领域普通技术人员将能得到相应的氨基酸序列。

42、在可选的实施方式中，mrna中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换。在一些实施方案中，置换尿苷的修饰核苷为假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5u)。

43、第二方面，本发明提供第一治疗性核酸分子组合物，所述第一治疗性核酸分子组合物包括，前述实施方式任一项所述的核酸分子混合物。

44、在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。

45、第三方面，本发明提供治疗性融合核酸分子，所述治疗性融合核酸分子包括前述实施方式任一项所述的核酸分子，所述核酸分子包括核酸分子片段(a)和核酸分子片段(b)，在可选的实施方式中，还包括核酸分子片段(c)。

46、在可选的实施方式中，至少任意两个核酸分子片段通过linker连接。

47、在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。

48、第四方面，本发明提供第二治疗性核酸分子组合物，所述第二治疗性核酸分子组合物包括前述实施方式所述第一治疗性核酸分子组合物和前述实施方式所述治疗性融合核酸分子的组合。

49、在可选的实施方式中，所述第二治疗性核酸分子组合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。

50、第五方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物在制备抗实体瘤药物或者实体瘤药物药效评价中的应用。

51、在可选的实施方式中，所述核酸分子或核酸分子混合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。

52、在可选的实施方式中，所述实体瘤包括上皮肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前列腺瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、胃肠道瘤、肝瘤、结肠直肠瘤、血管瘤、间皮瘤、胰脏瘤、乳房瘤、肉瘤、肺瘤、结肠瘤、脑瘤、黑色素瘤、小细胞肺瘤、神经母细胞瘤、睾丸瘤、癌瘤、腺癌瘤、神经胶质瘤、精细胞癌瘤、视网膜母细胞瘤或骨肉瘤。

53、第六方面，本发明提供治疗实体瘤的核酸分子药物，所述核酸分子药物包括核酸分子组分和包裹核酸分子组分的载体；

54、所述核酸分子组分选自前述实施方式任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物。

55、在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。

56、在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。

57、在可选的实施方式中，所述载体包括脂质体纳米颗粒。

58、在可选的实施方式中，所述核酸分子组分中的每一种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。

59、在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。例如两种游离的核酸分子片段，或三种游离的核酸分子片段，或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。

60、在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹。例如两种游离的核酸分子片段，或三种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹。

61、在可选的实施方式中，至少一种游离的核酸分子片段和一种融合核酸分子被脂质体纳米颗粒共同包裹。

62、在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；20％～50％的dopg，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；5％～20％的胆固醇，例如可以为但不限于为5％、10％、15％或20％；和1％～5％的peg-dmg，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％。

63、在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的dlin-mc3-dma、10％的dopg、38.5％的胆固醇和1.5％的peg-dmg。

64、在可选的实施方式中，还包括治疗性蛋白或治疗性化学药用组分。

65、在可选的实施方式中，所述治疗性蛋白包括阿替利珠单抗。

66、第七方面，本发明提供前述实施方式任一项所述核酸分子药物的制备方法，将游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子溶解于缓冲液中得到水相，量取脂质体纳米颗粒各脂质组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸分子药物。

67、在可选的实施方式中，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，优选为1:3。

68、在可选的实施方式中，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，优选为柠檬酸盐缓冲液。

69、在可选的实施方式中，所述缓冲液的ph为3～7，优选为4。

70、在可选的实施方式中，水相中游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的浓度为0.05mg/ml～0.5mg/ml，优选为0.1mg/ml。

71、在可选的实施方式中，所述有机溶剂选自c1～c4低碳醇，优选为无水乙醇。

72、在可选的实施方式中，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/ml～7mg/ml，优选为6mg/ml。

73、在可选的实施方式中，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂；

74、优选地，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12ml/min。

75、在可选的实施方式中，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的终浓度为50μg/ml～200μg/ml，优选为100μg/ml。

76、第八方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括前述实施方式任一项所述的核酸分子药物，或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的核酸分子药物。

77、在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括蛋白类药物，所述蛋白类药物选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、抗dc20抗体、抗her2抗体、抗cd33抗体、抗cd52抗体、抗vegfr抗体、抗egfr抗体、抗rankl抗体、抗cd30抗体、抗vegfr2抗体、抗gd2抗体、抗cd38抗体、抗cd22抗体和抗cd33抗体中的至少一种。

78、在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括阿替利珠单抗、纳武单抗、帕母单抗、pidilizumab、阿唑单抗、durvalumab、阿曲单抗和伊匹木单抗中的至少一种。

79、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

80、本发明提供的以编码il-7蛋白，和，编码白细胞介素il-12的p35和p40亚基的核酸分子片段为主要组分的核酸分子或核酸分子混合物，能够全面激活多种免疫细胞活性，实现对实体瘤的有效治疗。

81、本发明还提供了包含上述核酸分子片段的不同组合形式的核酸分子，所述组合形式包括不同核酸分子片段的融合，和不同核酸分子片段以游离形式形成组合物，经验证，本发明提供的两类核酸分子片段无论是采用游离形式组合，还是制备成融合核酸分子均对实体瘤表现出有效的治疗作用。

82、本发明还进一步使用适配载体与上述核酸分子组合物或融合核酸分子复合得到核酸分子药物，并给出了相应的制备方法，以期缓解目前实体瘤治疗对药物的迫切需求。