可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株的构建及其应用的制作方法

本发明属于生化工程领域，涉及用于联产支链氨基酸，如缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的基因工程菌及其应用。

背景技术：

1、支链氨基酸(branchedchainaminoacid，bcaa)是指α-碳上含有分支脂肪烃链的中性氨基酸，包括l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-缬氨酸，属于人和动物必需氨基酸。三种分支链氨基酸的生物合成途径，部分共享相同的前体物质和酶。支链氨基酸不能被高等动物自身合成，只能通过食物补充。支链氨基酸占必需氨基酸的40％，其足够的添加量及合理的比例对动物的正常发育十分重要。支链氨基酸的主要功能包括：细胞吸收能量增加，细胞活力提升，延缓细胞衰老，清除自由基，提升组织器官功能，抗疲劳，皮肤美容，提高心肺、心肌能力，提高心脑血管保护作用，降低脂肪，抗心力衰竭，骨骼肌合成以及提高免疫力。支链氨基酸在食品、医药、保健品、饲料、化妆品等领域均有着重要的应用。

2、l-缬氨酸(l-valine)可以补充营养，促进身体生长，提供能量。l-缬氨酸也可用于输液和注射液，促进外科创伤愈合。l-缬氨酸还是幼仔猪和肉鸡粗蛋白饲料中五种限制性氨基酸之一，其长期缺乏对动物生长性能会产生不利影响。近些年，作为一种重要的饲料日粮氨基酸品种，l-缬氨酸需求量持续增加。饲料级l-缬氨酸的出口量达到3万吨以上，年均增长率20％，市场前景非常良好。l-亮氨酸(l-leucine)在刺激肌肉蛋白合成和维持葡萄糖稳态中具有重要作用。l-亮氨酸也被用作一种调味剂和片剂生产的润滑剂。l-异亮氨酸(l-isoleucine)具有促进体内蛋白质、酶和肽类激素合成等功能，在具有各种生理功能的生命代谢过程中起重要作用，被广泛应用于饲料、医药、食品等行业。

3、支链氨基酸的生产方法有提取法、化学合成法、微生物发酵法等。提取法和化学合成法由于原料来源受限，生产成本高，难以实现工业化生产。与其他大部分l-氨基酸的生产相似，微生物发酵法是当前工业生产支链氨基酸的主要方法。微生物发酵法原料成本低，反应条件温和，容易实现大规模生产。但是，目前我国以微生物发酵法生产bcaa的技术尚不成熟，发酵水平不高，导致发酵周期长，产酸偏低，杂酸多，成为影响我国支链氨基酸产业化应用的首要因素。特别是由于l-亮氨酸及l-异亮氨酸的合成途径长、反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。

4、微生物发酵法生产支链氨基酸是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过菌株诱变选育出各种营养缺陷型或氨基酸结构类似物抗性突变株，如粘质赛氏杆菌、乳糖发酵短杆菌、谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌等，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累支链氨基酸的目的。

5、迄今为止，提高支链氨基酸生产菌株的l-支链氨基酸产量，一方面取决于所选突变菌株是否具备大量积累l-支链氨基酸的潜在能力；另一方面取决于发酵生产环境条件和技术工艺。因此，改造优良的l-支链氨基酸发酵菌株并优化技术工艺，提高菌种产酸能力、简化提取工艺，对提高国内l-支链氨基酸产品生产竞争力具有重要经济价值。

技术实现思路

1、本发明在可生产异亮氨酸和/或缬氨酸的大肠杆菌宿主细胞中引入亮氨酸的合成途径，通过表达解除l-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuam、异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leub、异丙基苹果酸脱水酶编码基因leucd、芳香氨基酸转氨酶基因tyrb和亮氨酸外排蛋白基因leue，得以实现三种支链氨基酸的联产。本发明的具体方面包括：

2、本发明第一方面提供：一种可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株，所述菌株表达：

3、1)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸合成；

4、2)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸异构反应β-异丙基苹果酸；

5、3)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化β-异丙基苹果酸脱氢生成α-酮异己酸；

6、4)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化芳香氨基酸转氨至α-酮异己酸生成亮氨酸；

7、以及：

8、5)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化从苏氨酸生成丁酮酸；优选地，所述dna分子为实质上解除了l-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因；进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilva基因；

9、和/或

10、6)至少一个编码多肽的dna分子，该dna分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种；

11、所述dna分子至少一个的表达被增强。

12、在本发明的具体实施方式中，所述1)的dna分子为异丙基苹果酸合成酶编码基因leua，优选地，为解除l-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因，进一步优选的为g479c突变的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuam。

13、在本发明的具体实施方式中，所述2)的dna分子为异丙基苹果酸脱水酶编码基因leucd。

14、在本发明的具体实施方式中，所述3)的dna分子为异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leub。

15、在本发明的具体实施方式中，所述4)的dna分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrb。

16、在本发明的具体实施方式中，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱水酶基因(tdcb)、苏氨酸转运蛋白基因、支链氨基酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvc)、二羟酸脱水酶基因(ilvd)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilve)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。

17、本发明第二方面提供：联产缬氨酸与亮氨酸的工程菌株，所述菌株表达：

18、1)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸合成；

19、2)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸异构反应β-异丙基苹果酸；

20、3)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化β-异丙基苹果酸脱氢生成α-酮异己酸；

21、4)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化芳香氨基酸转氨至α-酮异己酸生成亮氨酸；

22、优选地，所述1)的dna分子为异丙基苹果酸合成酶编码基因leua，优选地，为解除l-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因，进一步优选的为g479c突变的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuam；

23、优选地，所述2)的dna分子为异丙基苹果酸脱水酶编码基因leucd；

24、优选地，所述3)的dna分子为异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leub；

25、优选地，所述4)的dna分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrb；

26、以及

27、6)至少一个编码多肽的dna分子，该dna分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种；

28、所述dna分子至少一个的表达被增强。

29、本发明第三方面提供：联产亮氨酸和异亮氨酸或联产三种支链氨基酸的基因工程菌株，所述菌株表达：

30、1)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸合成；

31、2)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸异构反应β-异丙基苹果酸；

32、3)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化β-异丙基苹果酸脱氢生成α-酮异己酸；

33、4)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化芳香氨基酸转氨至α-酮异己酸生成亮氨酸；

34、优选地，所述1)的dna分子为异丙基苹果酸合成酶编码基因leua，优选地，为解除l-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因，进一步优选的为g479c突变的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuam；

35、优选地，所述2)的dna分子为异丙基苹果酸脱水酶编码基因leucd；

36、优选地，所述3)的dna分子为异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leub；

37、优选地，所述4)的dna分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrb；

38、以及

39、5)至少一个编码多肽的dna分子，该多肽催化从苏氨酸生成丁酮酸；优选地，所述dna分子为实质上解除了l-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilva基因；和/或，所述dna分子为苏氨酸脱水酶的基因(tdcb)；

40、和

41、6)至少一个编码多肽的dna分子，该dna分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种；

42、所述dna分子至少一个的表达被增强。

43、如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱水酶基因(tdcb)、苏氨酸转运蛋白基因、支链氨基酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvc)、二羟酸脱水酶基因(ilvd)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilve)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。

44、如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，至少下列基因ldha、adhe、pta、poxb的活性分别或同时被减弱或消除。

45、如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述工程菌株为野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus)、短杆菌(brevibacterium)、酵母(yeast)、棒杆菌(corynebacterium)或链霉菌(streptomyces)。

46、如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收bcaa的能力，和或具有所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌bcaa的能力；优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸abc转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnq基因或抑制brnq基因的表达；进一步优选地敲除或突变livjkhmgf基因的一个或多个或抑制livjkhmgf基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygazh、brnef、yjeh或leue的表达被增强，进一步优选，增强ygazh、brnef或yjeh表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。

47、如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述工程菌株构建的方法包括质粒表达，基因组整合如crispr、lambda-red、噬菌体等介导的同源重组。

48、本发明第四方面提供：如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株在联产支链氨基酸中的应用，或制备含支链氨基酸的食品、保健品或饲料中的用途。

49、本发明第五方面提供：联产支链氨基酸的方法，其特征在于，包括步骤：

50、(i)在培养基中培养如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株；

51、(ii)从(i)的培养物中分离支链氨基酸。

52、在本发明具体的实施方式中，所述培养基中加入能转化为2-酮丁酸的原料；优选地，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、二氨基丁酸中的一种或几种。

53、有益效果：

54、本发明实现了两种或三种支链氨基酸的联产，而且联产工艺在总体葡萄糖的利用率上至少有30％以上的提高；本发明所述的基因工程菌株发酵周期短、产量高、转化率高，具有较高的生产应用价值。