CREBRF作为电离辐射损伤标志物或肿瘤放化疗靶点的应用

本发明涉及分子生物学和生物医药，具体涉及crebrf作为电离辐射损伤标志物或肿瘤放化疗靶点的应用。

背景技术：

1、随着涉核技术的发展及放射医学的进步，人们的工作和生活也与电离辐射息息相关。电离辐射(ionizing radiation，ir)作为一种影响人类健康的致损或致癌物质，能够诱导多种生物学效应。目前，主要来源于环境、医疗和职业的辐射暴露。人们在享受核工业和核医学所带来的便利的同时，应该更多地关注辐射所造成的损伤效应，探索快速、准确、高通量的电离辐射损伤标志物，检测或评估电离辐射损伤或暴露的风险，为核污染、核辐射事故和核灾难中等公共卫生事件中人群的分类和救治做好准备。目前常用于检测是否遭受电离辐射的生物学方法，包括临床指征、外周血淋巴细胞计数和细胞遗传学技术。生物标志物是一种可以被检测到的生化指标，能个性化地反映不同个体受到辐射损伤的情况，可靠的生物标志物对于快速准确评估电离辐射吸收剂量并实施有效的应对措施至关重要。电离辐射标志物的研究多聚焦在蛋白质、dna、rna及代谢产物等方向，基于rna的表观修饰的电离辐射标志物的研究较少。电离辐射能否导致rna的m6a修饰改变，这些修饰改变的基因或者编码的蛋白质在电离辐射损伤后细胞命运的抉择中发挥的作用有待探索。目前临床上仍缺乏更为及时、稳定、敏感、特异的电离辐射损伤标志物。

2、creb3(也称为luman)是creb家族(creb1、creb2和creb3)的主要成员。creb家族蛋白可以通过识别并结合与camp敏感基因的camp响应元件(camp response element，cre)调节转录。creb3转录因子家族是属于bzip家族的内质网定位蛋白。它们从内质网转运到高尔基体，被s1p和s2p蛋白酶切割，释放的n末端结构域充当转录因子。creb3家族成员调节多种基因的表达，在脂质代谢、发育、存活、分化、细胞器自动调节和蛋白质分泌等方面发挥作用。它们作为细胞分泌能力和细胞特异性的调节者，参与内质网和高尔基体应激反应。crebrf是creb3的特异性负调节因子，是一种未折叠的蛋白质反应依赖性亮氨酸拉链转录因子。可从细胞核中募集核creb3并促进creb3的降解。最近的研究发现crebrf-creb3轴心参与调节肿瘤细胞中的自噬，并且可以通过内质网应激途径参与诱导细胞凋亡，不仅如此，在一项全基因组关联研究中crebrf被确定为一种肥胖基因。

3、尽管有少量报道证实crebrf在内质网应激中发挥作用，但是crebrf在电离辐射导致的dna损伤后修复中的功能未见报道。电离辐射由于其高能量射线如x射线、γ射线，可以造成严重的dna双链断裂损伤。临床上通常利用放疗、化疗药物等手段诱导肿瘤细胞发生dna损伤，进而杀伤肿瘤细胞。目前电离辐射损伤后crebrf的表达调控、crebrf对细胞内dna修复过程的影响及crebrf作为肿瘤放化疗靶点的研究未见报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种生物标志物，或检测所述生物标志物的物质，或检测所述生物标志物rna的m6a修饰水平的物质在检测或评估电离辐射损伤或暴露程度中的应用，和/或，该生物标志物作为肿瘤放化疗靶点的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了生物标志物，或检测所述生物标志物的物质，或检测所述生物标志物rna的m6a修饰水平的物质的下述任一种应用：

3、a1)在检测或评估电离辐射损伤或制备用于检测或评估电离辐射损伤的产品中的应用；

4、a2)在检测或评估电离辐射暴露程度或制备用于检测或评估电离辐射暴露程度的产品中的应用；

5、所述生物标志物(电离损伤标志物)可为crebrf基因。

6、所述crebrf基因编码crebrf蛋白，所述crebrf基因及其编码蛋白质可为人源的。所述crebrf基因的核苷酸序列可为seq id no.1。

7、所述crebrf基因mrna的genbank登录号为nm_153607.3。

8、进一步地，所述crebrf基因的mrna在急性电离辐射刺激后m6a修饰水平显著升高，crebrf基因的表达水平显著降低，crebrf蛋白质的表达水平显著降低。

9、所述crebrf基因的表达量变化和/或所述crebrf蛋白质含量的变化可以作为判断受试者是否受到电离辐射损伤或暴露及暴露程度的依据。

10、所述crebrf基因的mrna的m6a修饰位点在crebrf mrna的cds区域和3’utr区域。

11、进一步地，急性电离辐射后crebrf基因的显著差异rnam6a修饰峰位于cds区域的外显子3和3’utr区。

12、所述检测所述生物标志物的物质包括下述至少任一种：

13、c1)特异性扩增crebrf基因的引物；

14、c2)特异性识别crebrf基因的探针；

15、c3)特异性结合crebrf基因的物质；

16、c4)特异性结合crebrf蛋白的物质。

17、所述检测所述生物标志物rna的m6a修饰水平的物质包括但不限于基于tlc(薄层色谱法，thin layer chromatography)、dot-blot(斑点印迹法)、lc-ms/ms(液相色谱串联质谱法)、merip-seq/m6a-seq(rna甲基化免疫沉淀测序)技术(包括m6a-seq2)、m6a-clip/miclip、m6a-seal-seq、m6a-sac-seq、nanopore direct rna seq、glori-seq、merip-qrt-pcr(merip-qpcr)、select(single-base elongation-and ligation-based qpcramplification method)和scarlet技术检测crebrf基因rna的m6a修饰水平的试剂。

18、上述应用中，所述检测所述生物标志物的物质可为下述至少任一种：

19、b1)用于检测crebrf基因的mrna表达水平的试剂；

20、b2)用于检测crebrf基因的蛋白质表达水平的试剂；

21、所述检测所述生物标志物rna的m6a修饰水平的物质包括基于merip-qpcr技术检测crebrf基因rna的m6a修饰水平的引物对。

22、上述应用中，所述引物对可包括下述至少任一种：

23、d1)由seq id no.2和seq id no.3所示的单链dna分子组成的引物对；

24、d2)由seq id no.4和seq id no.5所示的单链dna分子组成的引物对。

25、所述mrna表达水平是指在转录水平上检测基因转录的mrna的丰度；所述蛋白质表达水平是指在翻译水平上检测基因编码的蛋白质的丰度。

26、进一步地，b2)中所述用于检测crebrf基因的蛋白质表达水平的试剂包括用于检测crebrf蛋白含量的试剂，所述用于检测crebrf蛋白含量的试剂包括结合crebrf蛋白的物质，所述结合crebrf蛋白的物质包括抗体、多肽、蛋白质或核酸分子。

27、进一步地，所述抗体可为crebrf蛋白抗体。

28、所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体，还可以是抗体可变区fv、单链抗体scfv、抗原结合片段fab或fab’、f(ab’)2、fab’-sh等抗体片段，以及抗体衍生物等。

29、进一步地，所述检测crebrf蛋白含量可通过酶联免疫吸附试验(elisa)方法检测待测样本中crebrf蛋白的表达水平，但不限于该方法，本领域技术人员可以通过免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-pcr技术或生物素-亲和素技术等其他方法来检测crebrf蛋白含量。

30、本发明还提供了检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品，所述产品可包括本文中任一所述的检测所述生物标志物的物质和/或检测所述生物标志物rna的m6a修饰水平的物质。

31、所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、检测卡、高通量测序平台或生物传感器。

32、进一步地，所述产品的检测样本可为体液样本(如全血、血浆、血清或唾液等)及组织样本等但不限于此。

33、本发明还提供了所述生物标志物的下述任一种应用：

34、e1)作为靶点在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

35、e2)作为靶点在制备放疗增敏剂或化疗增敏剂中的应用。

36、所述靶点可为肿瘤放化疗靶点。

37、进一步地，所述生物标志物(crebrf基因或其编码的crebrf蛋白)的应用包括作为放疗、dna损伤化疗药物治疗肿瘤靶点的应用，所述应用是通过下调crebrf基因的表达量或下调crebrf蛋白含量，提高肿瘤细胞对化疗药物或放疗的敏感性。

38、本发明还提供了crebrf抑制剂的下述任一种应用：

39、f1)在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

40、f2)在制备放疗增敏剂或化疗增敏剂中的应用。

41、所述crebrf抑制剂可具有下述至少任一用途：

42、g1)抑制肿瘤细胞的增殖；

43、g2)提高肿瘤细胞对电离辐射的敏感性，或提高肿瘤的放射性治疗敏感性；

44、g3)将肿瘤细胞周期阻滞在g1/s期；

45、g4)促进肿瘤细胞的凋亡；

46、g5)抑制电离辐射诱导的或化疗药物诱导的dna损伤的修复；

47、g6)促进放射性治疗或化疗中肿瘤细胞的dna损伤；

48、g7)增强抗肿瘤放射性治疗或化疗的效果。

49、上述应用中，所述crebrf抑制剂可包括下述任一种：

50、h1)抑制crebrf基因的表达或活性的试剂；

51、h2)抑制crebrf基因转录为mrna的试剂；

52、h3)抑制crebrf基因翻译为蛋白质的试剂；

53、h4)抑制crebrf蛋白的活性或功能或降低crebrf蛋白含量的试剂。

54、所述抑制剂可包括抑制crebrf基因启动子的抑制剂。

55、h1)-h4)中所述的试剂包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂、小分子化合物、抗体、多肽、蛋白、基因编辑载体、慢病毒或腺相关病毒中的一种或多种。

56、进一步地，所述核酸分子可包括shrna、microrna、sirna和/或反义寡核苷酸。

57、进一步地，所述shrna(短发夹rna)、microrna(微小rna)、sirna(小干扰rna)和/或反义寡核苷酸(如反义rna)用于抑制crebrf基因的表达。

58、所述核酸分子可包括crebrf基因特异性的rnai、crebrf基因特异性的microrna。

59、进一步地，所述抗体可为抗crebrf蛋白的抗体或其功能性片段。

60、进一步地，所述蛋白可为crebrf蛋白的结合蛋白。

61、进一步地，所述慢病毒或腺相关病毒可为表达用于敲低crebrf基因的shrna的重组慢病毒或重组腺相关病毒。

62、上述应用中，所述试剂可包括shrna，所述shrna可包括下述任一种：

63、m1)所述shrna靶向干扰crebrf基因的表达；

64、m2)所述shrna的靶序列为seq id no.6或seq id no.7。

65、本文所述抑制crebrf基因表达可为沉默或敲除crebrf基因，可通过本领域技术人员所熟知的基因突变、基因沉默、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术实现。如利用rna干扰(rnai)技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达；利用基因编辑技术的工具可以是crispr/cas9技术、锌指核酸酶(zfns)或转录激活因子样效应物核酸酶(talens)技术等，但不限于此。

66、本文所述抑制crebrf基因转录为mrna或抑制crebrf基因翻译为蛋白质可利用基因敲减(基因敲低，gene knock-down)技术从转录后水平或翻译水平使crebrf基因表达失活或基因沉默，该技术为本领域技术人员所熟知。所述基因敲减技术包括rna干扰、morpholino干扰、反义核酸、核酶或显性负抑制突变但不限于此。

67、利用病毒(如慢病毒、腺相关病毒)表达的shrna或sirna抑制crebrf基因的表达，进行crebrf基因的沉默是本领域技术人员所熟知的。在本发明的一个或多个实施方案中，所述慢病毒可为表达靶向crebrf的序列为seq id no.6或seq idno.7的shrna的重组慢病毒。

68、具体地，所述重组慢病毒是将干扰shrna的编码dna分子克隆构建到慢病毒载体plko.1上，利用慢病毒包装系统包装获得慢病毒颗粒，得到的表达干扰shrna的重组慢病毒，所述干扰shrna的编码靶向crebrf的dna序列为seq id no.6或seq id no.7。

69、本发明还提供了用于预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物可包括本文中任一所述的crebrf抑制剂，所述药物组合物可具有下述至少一种用途：

70、n1)抑制肿瘤细胞的增殖；

71、n2)提高肿瘤细胞对电离辐射的敏感性，或提高肿瘤的放射性治疗敏感性；

72、n3)将肿瘤细胞周期阻滞在g1/s期；

73、n4)促进肿瘤细胞的凋亡；

74、n5)抑制电离辐射诱导的或化疗药物诱导的dna损伤的修复；

75、n6)促进放射性治疗或化疗中肿瘤细胞的dna损伤；

76、n7)增强抗肿瘤放射性治疗或化疗的效果。

77、所述药物组合物的活性成分可包括本文任一所述的crebrf抑制剂。

78、进一步地，所述药物组合物还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

79、本文中，所述肿瘤可包括宫颈癌和/或骨肉瘤。

80、本文所述肿瘤细胞可包括经过电离辐射或化疗药物处理的肿瘤细胞。

81、进一步地，所述肿瘤细胞包括宫颈癌细胞(如hela细胞)和/或骨肉瘤细胞(如u2os细胞)。

82、本文中，所述电离辐射损伤可为急性电离辐射损伤，进一步可为急性电离辐射早期损伤。

83、本文所述电离辐射损伤可包括电离辐射诱导的细胞dna损伤，所述细胞dna损伤可由电离辐射(如x射线或γ射线)诱导产生。

84、本文中，所述电离辐射可包括α射线、β射线、γ射线、x射线、电子束、质子束、重离子束、中子束辐射中的一种或几种。

85、进一步地，所述电离辐射可为x射线和/或γ射线。

86、本文所述放疗增敏剂可包括用于增强肿瘤放射性治疗敏感性的试剂或药物，或用于提高肿瘤放射性治疗效果的试剂或药物。

87、本文所述化疗增敏剂可包括用于增强化疗药物敏感性的试剂或药物，或用于提高肿瘤化疗效果的试剂或药物。

88、本文所述应用的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

89、本发明还提供了crebrf基因或crebrf蛋白作为放疗、dna损伤化疗药物治疗肿瘤靶点的应用。

90、进一步地，所述crebrf基因或crebrf蛋白作为放疗、dna损伤化疗药物治疗肿瘤靶点的应用是通过下调crebrf蛋白表达量，提高细胞对化疗药物或放疗的敏感性。

91、本发明还提供了一种体外治疗性抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括在crebr抑制剂存在的条件下，采用放化疗方法处理肿瘤细胞。

92、本发明提供了crebrf作为电离辐射损伤标志物或肿瘤放化疗靶点的应用。本发明首次发现电离辐射损伤后，crebrf的mrna的m6a修饰水平显著升高，crebrf的表达水平(包括mrna水平和蛋白质水平)显著降低，并以此开发了用于检测细胞电离辐射损伤的生物标志物crebrf。进一步以crebrf为靶点研究crebrf基因及其编码蛋白在预防或治疗肿瘤中的应用。本发明在肿瘤细胞系(如hela或u2os细胞)中通过慢病毒介导的shrna进行crebrf基因的敲减，下调crebrf的表达(降低crebrf基因或其编码蛋白的表达)，结果表明，下调crebrf的表达能够抑制包括宫颈癌与人骨肉瘤细胞在内的细胞增殖，增加电离辐射对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用，提高肿瘤细胞对电离辐射的敏感性，提高肿瘤的放射性治疗敏感性，还可促进细胞凋亡，调控细胞周期，促进细胞周期阻滞于g1/s期，并可以抑制电离辐射和/或化疗药物诱导的dna损伤的修复，加重细胞dna损伤，进而促进肿瘤细胞的凋亡，达到杀伤肿瘤的目的。因此，本发明提供了新的电离辐射损伤标志物，新的宫颈癌与骨肉瘤的治疗靶点，为本领域提供了一种新颖的宫颈癌与骨肉瘤诊断剂和/或治疗剂，可用于宫颈癌、骨肉瘤等肿瘤治疗方案的选择或预后评估，具有广泛的临床应用前景。