一种固态发酵泡菜菌剂及其制备方法

本发明属于泡菜菌剂，具体涉及一种固态发酵泡菜菌剂及其制备方法。

背景技术：

1、四川泡菜又叫泡酸菜，一年四季都可以制作。四川泡菜制作简单，易于储存，食用方便。因为是冷加工，有益成分损失较少，所以营养丰富，是很好的低热量食品。传统的泡菜主要采用自然发酵的方法进行制备，自然发酵周期长，而且容易污染杂菌造成发酵失败或产生对人体有害的物质，而且，即使发酵成功也会导致发酵质量不稳定，存在一定的安全隐患。因此，目前制备泡菜时，一般会人工的添加一些微生物菌剂，利用微生物菌剂诱导发酵进程，缩短发酵周期，提高泡菜质量。目前的微生物菌剂一般为固态，大多采用冷冻干燥的方式制备，但是该方法耗能大，制备时间久；也有采用热风干燥的方式进行进行制备，但是，由于微生物对温度比较敏感，热风干燥方式又是依靠温度将物料中的水分蒸发，干燥过程中如果掌握不好温度，极易造成微生物死亡，导致制备的固态菌剂中活性菌的含量较低，影响固态菌剂的发酵效果；而且，现有的人热风干燥方式制备的泡菜菌剂的货架期较短，微生物在存放的过程中也容易死亡，影响使用。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种固态发酵泡菜菌剂及其制备方法，本技术中的泡菜菌剂采用热风干燥的方式制备获得，该泡菜菌剂可有效解决现有的泡菜菌剂存在的微生物含量低，货架期短等问题。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种固态发酵泡菜菌剂的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)分别将植物乳杆菌、短乳杆菌、戊糖乳杆菌和双歧杆菌菌种活化并进行增殖培养，当增殖期结束时，将菌种进行梯度温度培养；

5、(2)菌种梯度温度培养至稳定期时，将菌种离心，得菌泥，向菌泥中加入由低聚木糖、低聚果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、d-甘露糖醛酸钙、l-古罗糖醛酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和casein peptide phosphate组成的第一层包埋剂，混匀；然后向其中添加由甘葡聚糖醛基化酪阮蛋白酸钠和羧甲基葡聚糖钠组成的第二层包埋剂，混匀；再向其中添加由d-(+)-trehalose dihydrate、葡甘聚糖、蔗糖酯和cmc组成的第三层包埋剂，混匀；最后，将加入三层包埋剂的菌液添加至由棉子糖、低聚木糖、β-环状糊精、α-环状糊精和γ-环状糊精组成的第四层包埋剂中，混匀，制得包埋菌液；

6、(3)将包埋菌液升温至40-45℃，然后向其中添加钙盐粉末，同时，在助干剂和保护剂的作用下，进行喷雾干燥，制得粉体菌剂；

7、(4)分别将植物乳杆菌、短乳杆菌、戊糖乳杆菌和双歧杆菌粉体菌剂按照4-6:0.5-1.5:0.5-1.5:0.3-0.8的质量比混合，制得固态发酵泡菜菌剂。

8、进一步地，步骤(1)中植物乳杆菌的增殖培养基成分及浓度为：c4h10o4 6-7g/l，c6h12o6 2-3g/l，c2h5no2 3-4g/l，c12h22o11 2-3g/l，蛋白胨8-9g/l，脱脂乳粉10-11g/l，k2hpo4 1-2g/l，kh2po4 0.5-1g/l，caso4 0.5-1g/l，mgso40.1-0.3g/l，nano3 0.1-0.2g/l，feso4.7h2o 0.5-1.5g/l，d-核糖、d-木糖和l-阿拉伯糖总量9-11g/l，d-核糖、d-木糖和l-阿拉伯糖质量比为0.5-1.5:1-3:0.4-0.7，nicotinamide mononucleotide 9-11mg/l，葡萄糖酸钙28-32mg/l，三磷酸腺苷二钠0.0005-0.0015g/l，蔗糖酯0.03-0.05g/l和自来水，培养基ph值为6-6.3；增殖培养温度为29-31℃，培养时间为22-26h。

9、进一步地，步骤(1)中短乳杆菌的增殖培养基成分及浓度为：α-氨基戊二酸一钠180-200g/l，c6h12o6 15-16g/l，脱脂乳粉18-19g/l，酵母提取物4-5g/l，蛋白胨7-8g/l，牛肉膏11-12g/l，柠檬酸氢二铵8-9g/l，柠檬酸二钠4-5g/l，乙酸铵1-2g/l，蔗糖酯0.05-0.07g/l，nacl 2-3g/l，k2hpo4 5-6g/l，kh2po4 3-7g/l，mnso4 0.4-0.6g/l，mgso4 0.05-0.08g/l，znso4 0.03-0.05g/l，feso40.0007-0.0009g/l和自来水，培养基ph值为6.3-6.5；增殖培养温度为34-36℃，培养时间为23-25h。

10、进一步地，步骤(1)中戊糖片球菌的增殖培养基成分及浓度为：全种类氨基酸12-13g/l，低聚木糖、鼠李糖、半乳糖、l-阿拉伯糖、d-木糖和甘露糖醇总质量浓度为13-14g/l，低聚木糖、鼠李糖、半乳糖、l-阿拉伯糖、d-木糖和甘露糖醇质量比为3-5:0.5-1.5:0.5-1.5:1-3:0.5-1.5:0.5-1.5，l-c5h8nnao4 2-3g/l，酵母浸提粉2-3g/l，c6h12o6 11-12g/l，胰蛋白胨9-10g/l，柠檬酸二钠2-3g/l，乙酸钠1-2g/l，k2hpo4 1-2g/l，kh2po4 0.8-1g/l，feso40.07-0.1g/l，cacl20.4-0.6g/l，卷心菜和大白菜压榨蔬菜汁120-130ml/l，nicotinamidemononucleotide 9-11mg/l，folinic acid 190-210mg/l，pantothenic acid 45-55mg/l，biotin 45-55mg/l，riboflavin 15-25mg/l，甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷0.0002-0.0004g/l和自来水，培养基ph值为6.9-7.1；增殖培养温度为36-37℃，培养时间为48-96h。

11、进一步地，步骤(1)中双歧杆菌的增殖培养基成分及浓度为：脱脂乳粉11-12g/l，c6h12o6 6-7g/l，肝浸粉1-2g/l，胰酪蛋白胨1-2g/l，木三糖0.2-0.3g/l，低聚木糖13-14g/l，低聚果糖2-3g/l，水苏糖1-2g/l，番茄汁和黄瓜汁总量2-3g/l，k2hpo4 2-3g/l，kh2po40.05-0.08g/l，维生素a 0.08-0.1g/l，nano3 4.5-5.5g/l，cacl2 0.005-0.015g/l，异抗坏血酸钠0.4-0.6g/l，l-cys 0.01-0.03g/l，na2moo4·2h2o 0.1-0.25g/l，na2seo4·2h2o0.005-0.015g/l，mnso4.h2o0.005-0.015g/l，mgso4 0.1-0.3g/l，feso4.7h2o 0.005-0.015g/l，维生素k10.006-0.007g/l，甲硫氨酸0.004-0.006g/l，缬氨酸0.001-0.003g/l，naoh 0.002-0.003g/l，nahco3 0.5-0.6g/l，cmc-na 0.4-0.6g/l和水，培养基ph值为6.5-7.0；增殖培养温度为36-37℃，培养时间为48-96h。

12、进一步地，步骤(1)中植物乳杆菌梯度温度培养条件为：于30-35℃起始温度条件下以1℃/30min的速度升温至36-42℃，然后向其中添加温度保护剂，然后以0.5℃/h的速度升温培养；

13、短乳杆菌梯度温度培养条件为：于28-30℃起始温度条件下以1℃/30min的速度升温至31-35℃，然后向其中添加温度保护剂，然后以0.5℃/h的速度升温培养；

14、戊糖乳杆菌梯度温度培养条件为：于32-37℃起始温度条件下以1℃/30min的速度升温至38-44℃，然后向其中添加温度保护剂，然后以0.5℃/h的速度升温培养；

15、双歧杆菌梯度温度培养条件为：于37-41℃起始温度条件下以1℃/30min的速度升温至43-47℃，然后向其中添加温度保护剂，然后以0.5℃/h的速度升温培养。

16、进一步地，步骤(1)中温度保护剂成分及质量浓度为：d-(+)-trehalosedihydrate)80-95g/l，葡萄糖酸钙2.5-12.5g/l，proline 2.34-12.78g/l，spermidine0.05-0.09g/l，spermin 0.01-0.07g/l，4-aminobutyric acid 0.02-0.09g/l，p-aminobenzoic acid 0.001-0.007g/l；温度保护剂的添加量为菌种重量的12.5-22.5％。

17、进一步地，步骤(2)中所述第一层包埋剂中低聚木糖、低聚果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、d-甘露糖醛酸钙、l-古罗糖醛酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和casein peptidephosphate的质量比为9-11:1-3:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:0.4-0.6:0.4-0.6:3-5；第一层包埋剂添加量为菌泥质量的3.5-7.5％；

18、第二层包埋剂中甘葡聚糖醛基化酪阮蛋白酸钠和羧甲基葡聚糖钠的质量比为1:1，第二层包埋剂添加量为菌泥质量的1.5-3.5％；

19、第三层包埋剂中d-(+)-trehalose dihydrate、葡甘聚糖、蔗糖酯和cmc的质量比为2-4:1-2:0.5-1:0.2-0.4，第三层包埋剂添加量为菌泥质量的3.5-4.5％；

20、第四层包埋剂中棉子糖、低聚木糖、β-环状糊精、α-环状糊精和γ-环状糊精的质量比为2-4:0.5-1:0.1-0.3:0.5-1.5:0.5-1.5，第四层包埋剂添加量为菌泥质量的21.5-27.5％。

21、进一步地，步骤(3)中钙盐粉末为碳酸钙、氯化钙和硫酸钙按照2-4:0.5-1.5:0.03-0.05的质量比混合制成；钙盐粉末在包埋菌液中的质量浓度为0.4-0.6％；

22、助干剂为β-环状糊精，助干剂用量为包埋菌液质量的2.8-4.5％；

23、保护剂由l-arginine、d-glucitol、casein和脱脂乳粉按照0.005-0.015:0.5-1.5:0.04-0.07:0.5-1.5的质量比混合制成，保护剂在包埋菌液中的质量浓度为3.5-4.2％；

24、喷雾干燥过程参数：真空度：-0.03～-0.05mpa、喷嘴口径：0.3-0.6mm、进口温度：58.5-69.8℃、出口温度：30-50℃、热蒸汽流速为：22.5-27.8n3/h、包埋菌剂泵入速率为15-20ml/min、喷雾附聚角度为10.2-11.5°。

25、一种固态发酵泡菜菌剂，采用上述的方法制得。

26、本发明所产生的有益效果为：

27、1、本技术中的在菌种增殖培养中添加了部分保护剂成分，既能提高微生物活力，延长微生物的稳定期，又能提高微生物对保护剂的耐受性，为后续包埋和喷雾干燥打下基础，降低后续包埋和喷雾干燥过程中微生物的死亡率，进而提高固体菌剂中微生物含量，延长存放货架期和发酵效果。具体为：植物乳杆菌增殖培养基中添加c6h12o6可以作为菌株高速增殖的启动因子，提高增殖效果；添加特定比例的无机盐成分，可以稳定菌体细胞结构以及增加细胞通透性，促进细胞增殖；短乳杆菌增殖培养基中添加脱脂乳粉可以减少α-氨基戊二酸一钠的用量，蔗糖酯作为培养基乳化剂、分散剂，可以提高菌体对营养成分的利用效率，减少菌体易团结的问题；戊糖片球菌增殖培养基中添加卷心菜和大白菜压榨蔬菜汁，通过控制蛋白和五碳糖的比例调控菌株对五碳糖、蛋白质类物质的需要，使其适应泡菜基质的环境，提高发酵过程中发酵效果；双歧杆菌培养基中添加脱脂乳粉，减少了氨基酸含量，同时添加有低聚木糖、低聚果糖、水苏糖等成分，可促进菌株增殖；添加有黄瓜汁和番茄汁，增加菌株适应泡菜环境的能力。

28、2、本技术中对增殖培养的菌株进行梯度温度培养，以增加菌株对喷雾干燥温度的适应能力，提高喷雾干燥过程中菌株的成活率，进而获得微生物含量更高的发酵菌剂。

29、3、本技术中采用由低聚木糖、低聚果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、d-甘露糖醛酸钙、l-古罗糖醛酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和casein peptide phosphate组成的第一层包埋剂对菌株进行包埋，第一层包埋剂既能稳定菌株的生长状态，又能作为外界环境的缓冲层，其中乳糖醇和赤藓糖醇作为保护剂，可降低空气或其他条件造成的菌体失活量；同时，该包埋层可在发酵过程中为菌株提供营养成分，并且实现一定的缓冲效果，可以促进菌株在发酵环境中快速增殖；

30、由甘葡聚糖醛基化酪阮蛋白酸钠和羧甲基葡聚糖钠组成的第二层包埋剂中含有大量醛基和疏水性基团，可以提高包埋菌体的乳化稳定性，提高包埋剂持水力和包埋黏度，诱导菌体与包埋剂的蛋白质基团自行组装，形成更大的包埋颗粒，提高菌体的包埋率和延长活性；

31、由d-(+)-trehalose dihydrate、葡甘聚糖、蔗糖酯和cmc组成的第三层包埋剂，第三层包埋剂成分作为壁材，可以隔绝外部环境，对菌株起到保护作用，减少菌体失活率，降低喷雾干燥过程中菌株的死亡率，提高终产品中菌株的数量；

32、最外层包埋剂由多种糊精混合而成，既起到包埋和保护内部菌体和维持内部包埋层的稳定的作用，同时改善喷雾干燥处理后的干燥颗粒的性能，最重要的是，前三层包埋使用了蛋白基包埋剂和d-(+)-trehalose dihydrate，最后一层使用不同类型的糊精，可以改善d-(+)-trehalose dihydrate在喷雾干燥过程中的强聚集性，更有效的减少粒子集聚，得到较大的包埋粒子，且在本发明调整下将蛋白基包埋剂、d-(+)-trehalose dihydrate、多种糊精(复配)起到了协同作用，规避了各自在喷雾干燥高温气体动力学中的不稳定性和不协调性，同时糊精本就作为最后一层包埋剂起到保护作用，在调整到最优比例后，可以提高喷雾干燥后的菌体存活率和最佳的颗粒性质，便于制备松散优质的菌粉。