一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法

本发明具体涉及一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法，属于微生物发酵领域。

背景技术：

1、贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种，得益于芽孢杆菌的芽孢结构，芽孢杆菌通常耐受性较强，即使在极端环境也能生存，因此其应用范围较广，现有专利中报道（公开号为cn109576179a的中国发明专利）贝莱斯芽孢杆菌能够耐受10 %盐浓度。目前关于贝莱斯芽孢杆菌的应用主要集中于促进植物生长和生物防治领域，较少关于降解工农业副产物纤维素方面的报道。纤维素的生物处理法是指通过微生物发酵产生的纤维素酶降纤维素，微生物发酵过程中还会产生有机酸和各种活性物质，可改善饲料营养价值，是目前纤维素降解的研究热点。

2、酱油渣是酱油酿造的副产物，新鲜酱油渣含水量高，极易腐败变质。酱油渣约含20%-30%的粗蛋白，5%-15%的粗脂肪和丰富的大豆异黄酮等营养物质，是较有潜力的蛋白饲料资源，具有一定的饲用价值。但因其较高的粗纤维含量（约20%-30%），直接用于饲料会使饲料适口性差，造成动物采食量和机体消化率偏低，另外，酱油渣的含盐量亦偏高，一般在8%以下，含盐量高抑制了部分微生物的生长，且经过饲料加工过程中的热处理后，大部分菌株无法存活，动物胃肠液中的低酸环境和胆盐等抗生长因素亦不利于菌株生存。

3、因此，筛选高产纤维素酶且能耐受一定的盐、高温、模拟胃肠液和胆盐的细菌，充分降解酱油渣中的粗纤维，进入动物机体内发挥益生特性，是酱油渣饲料化利用的关键。

技术实现思路

1、本发明从酱醪样品中筛选出一株芽孢杆菌，经16s rrna比对分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（ bacillus velezensis）。该菌株高产纤维素酶，对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐耐受性较强，说明其有具有较好的纤维素降解应用潜力，可作为酱油渣等以高盐物质为原料的发酵饲料候选菌株。

2、本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌（ bacillus velezensis）fhzjl-221，所述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63139，保藏日期为2023年02月28日。

3、所述的贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221筛选自酱醪，对菌株进行菌株形态学和分子鉴定，所筛菌株与贝莱斯芽孢杆菌的16s rrna序列相似性高达99%以上，将其命名为贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221。

4、所述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221的菌株形态学特征为，菌落大致呈乳白色圆形，边缘不规则，中央微凸，表面较粗糙且有皱褶。在显微镜下观察菌体呈杆状，单个或成对排列。

5、在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221能在盐度为0~10%的lb培养基下生长。

6、在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221能在50℃~90℃水浴10 min的处理下存活。

7、在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221能在模拟肠和模拟胃液处理3 h下存活，能在0.1~0.5%浓度胆盐处理4 h下存活。

8、本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221，或含有其发酵液，或含有其冻干粉，或含有其裂解物。

9、在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221的含量不少于：1×105cfu/ml或1×106cfu/g。

10、本发明提供了一种产品，所述产品中含有上述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221或上述微生物菌剂。

11、在本发明的一种实施方式中，所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌的含量不少于：1×105cfu/ml或1×106cfu/g。

12、在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。

13、在本发明的一种实施方式中，所述化学品包括但不限于纤维素降解剂、脱毛剂、饲料添加菌剂、益生菌剂。

14、本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221或上述微生物菌剂在制备降解纤维素中的产品中的应用。

15、在本发明的一种实施方式中，所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221的含量不少于：1×105cfu/ml或1×106cfu/g。

16、本发明还提供了一种降解纤维素的方法，所述方法为，向含有纤维素的反应体系中添加上述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221，或上述微生物菌剂。

17、本发明还提供了一种发酵产纤维素酶的方法，所述方法为先将上述贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液后离心取上清即为粗酶液。

18、本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221的产纤维素酶条件的响应面优化方法，步骤如下：

19、步骤一：进行单因素实验，包括菌株的培养时间、接种量、培养温度和起始ph；

20、步骤二：在单因素实验的基础上，应用design expert 12软件根据box-behnken实验设计原理，设计4因素3水平实验方案进行响应面实验分析；

21、步骤三：根据步骤二设计的实验方案完成实验，得到对应各组的纤维素酶活；

22、步骤四：根据实验结果建立模型回归方程并进行方差分析，输出响应面图并判断各参数对响应值的影响情况，最终根据优化结果得到关于菌株fhzjl-221最佳的产酶条件。

23、在本发明的一种实施方式中，步骤四所确定优化的最佳产酶条件组合为：培养时间58 h、接种量5.0%、培养温度37.0 ℃、起始ph为6.0。

24、在本发明的一种实施方式中，步骤1所述的产酶条件范围如下：培养时间为12、24、36、48、60、72、84 h，接种量为2%、4%、6%、8%、10%、12%，培养温度为27、32、37、42、47、52 ℃和起始ph为5、6、7、8、9、10。

25、有益效果

26、（1）本发明得到一株对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐耐受性较强的高产纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221，产纤维素酶活力较高，经产酶条件优化后羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别达343.45±5.23 u/ml和167.62±3.89 u/ml，是一株具有良好耐受性的高产纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌，具有降解高盐度物质纤维素与作为饲料添加菌剂的潜力。

27、（2）本发明的贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐均具有较好的耐受性，结果表明贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221能耐受最高10%的盐浓度，在90℃水浴下处理10 min后依然能存活，并对模拟胃肠液和0.1~0.5%浓度的胆盐耐受性良好，良好的耐受性说明该菌株在经过饲料热加工处理后可存活，并有望进入动物体内发挥其益生特性。

28、（3）本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌fhzjl-221的产纤维素酶条件的响应面优化方法，确定了培养时间、接种量和起始ph和培养温度间的最佳组合和交互关系，优化后羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别提高7%和35%。

29、生物材料保藏：

30、一株贝莱斯芽孢杆菌（ bacillus velezensis）fhzjl-221，分类命名为 bacillus  velezensis，已于2023年02月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：63139，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。