LSA10563基因及其在调控生菜育性中的应用

本发明涉及生物中，lsa10563基因及其在调控生菜育性中的应用。

背景技术：

1、生菜(lactuca sativa l.)是菊科莴苣属植物，起源于欧洲地中海沿岸和西亚一带，由野生种驯化而来，是全球范围内三大叶菜之一，具有重要的经济价值。过去的二十年，全球产量增加了一倍。作为全球的通用蔬菜，生菜在我国的需求和消费也在不断增加，目前已经成为国民菜篮子当中的重要蔬菜。

2、生菜是二倍体植物，严格自花授粉，天然异交率极低，花器官很小且每朵花开花时间持续短，杂交困难，很难获得杂交种。目前生产用种子一般是自交系。前期实验室观察到生菜在产量、抗病虫害等方面具有明显的杂种优势，因此创制雄性不育系用于生产生菜杂交种在生产上具有重要意义。

3、近年来随着crispr/cas9基因编辑技术的大力发展，可以直接实现动植物基因的靶向敲除、敲入和定点突变，快速创建目标性状突变体，现已利用该技术在玉米、水稻、大白菜、油菜、小麦等多种作物中实现雄性不育突变体构建，但在生菜中未见相关报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何培育雄性不育植物。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质含量或活性的物质在调控植物雄性育性中的应用；

3、所述蛋白质名称为lsa10563，其为如下a1)、a2)或a3)：

4、a1)氨基酸序列是seq id no.3的蛋白质；

5、a2)将序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

6、a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

7、所述调控lsa10563含量或活性的物质可为抑制或提高lsa10563含量或活性的物质。所述调控植物雄性育性可为抑制或提高植物雄性育性。

8、上述a2)中的lsa10563蛋白质，为与seq id no.3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

9、上述应用中，所述物质可为下述b1)至b9)中的任一种：

10、b1)编码lsa10563的核酸分子；

11、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

12、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

13、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

14、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

15、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

16、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；

17、b8)降低lsa10563含量或活性的核酸分子；

18、b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

19、上述应用中，b1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

20、b11)编码序列是序列表中seq id no.2的cdna分子或dna分子；

21、b12)序列表中seq id no.2所示的dna分子；

22、b13)序列表中seq id no.1所示的dna分子；

23、b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码lsa10563的cdna分子或dna分子；

24、b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码lsa10563的cdna分子或dna分子；

25、b8)所述核酸分子为靶向b1)所述核酸分子的sgrna；

26、b9)所述重组载体、所述重组微生物、所述转基因植物细胞系、所述转基因植物组织或所述转基因植物器官还能表达cas9蛋白质。

27、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

28、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码lsa10563蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的lsa10563蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码lsa10563蛋白质且具有lsa10563蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

29、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

30、上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

31、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

32、上述应用中，b2)所述的含有编码lsa10563蛋白质的核酸分子的表达盒(lsa10563基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达lsa10563蛋白质的dna，该dna不但可包括启动lsa10563基因转录的启动子，还可包括终止lsa10563基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

33、可用现有的表达载体构建含有所述lsa10563基因表达盒的重组载体。

34、上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pkse401载体。

35、b8)所述sgrna的靶序列可为sgrna1：ggtgccacaactctctatc；和/或，sgrna2：agatgggttcggacttagc。

36、b9)所述重组载体可为利用crispr/cas9系统制备的可以降低lsa10563含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向b1)所述核酸分子的sgrna。

37、上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如根癌农杆菌gv3101。

38、上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

39、本发明还提供了下述x1)或x2)：

40、x1)一种抑制植物雄性育性的方法，包括：降低受体植物中lsa10563的含量或活性，或抑制受体植物中lsa10563编码基因的表达，或敲除受体植物中lsa10563编码基因，得到与所述受体植物相比雄性育性降低的目的植物，实现植物雄性育性的抑制；

41、x2)一种培育雄性育性降低植物的方法，包括：降低受体植物中lsa10563的含量或活性，或抑制受体植物中lsa10563编码基因的表达，或敲除受体植物中lsa10563编码基因，得到与所述受体植物相比雄性育性降低的目的植物。

42、上述方法中，x1)与x2)所述方法可通过crispr/cas9系统对lsa10563的编码基因进行基因编辑实现。

43、所述编码基因可为所述核酸分子。

44、x1)与x2)所述方法具体可通过向所述受体植物中导入b9)所述重组载体得到lsa10563基因编辑植物实现。

45、在本发明的一个实施例中，x1)与x2)所述方法通过缺失序列1的第108-112位和/或缺失序列1的第108-116位实现。

46、本发明还提供了抑制植物雄性育性的产品，所述产品含有(或其活性为)所述调控lsa10563含量或活性的物质。

47、本发明中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：

48、m1)双子叶植物或单子叶植物；

49、m2)菊科植物；

50、m3)生菜。

51、lsa10563或所述调控lsa10563含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。

52、实验证明，将本发明的lsa10563基因编辑后，可使植物的雄性育性显著降低，说明，lsa10563基因及其编码的蛋白质可调控植物的雄性育性，可通过敲除该基因培育雄性不育植株，具有很好的应用前景。

53、下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。