一种5-乙酰氨基-3-对苯甲酸偶氮基-4-萘酚-2,7-二磺酸的合成方法及应用

本发明属于化学合成技术及免疫学，具体涉及一种5-乙酰氨基-3-对苯甲酸偶氮基-4-萘酚-2,7-二磺酸的合成方法以及该化合物在红2g单克隆抗体制备中的应用。

背景技术：

1、红2g又叫做酸性红1、食品红10和8-乙酰氨基-2-苯偶氨基-1-萘酚基-3,6-二磺酸二钠盐，由于其价格低廉、着色力强，常作为一种食品着色剂用于熟肉制品、香肠、果酱、含酒精饮料、蛋和奶产品中。人食用红2g会引起中毒，长期食用甚至会致癌。2007年7月，欧盟27国宣布禁止在食品中使用红2g。随后中国、美国、加拿大、日本等国家也明确禁止在食品中使用红2g。但是，近年来食品中非法添加工业染料的现象屡有发生，各国市售的熟肉制品及调味品、食品包装等均曾检出红2g。

2、红2g目前大部分采用仪器法进行检测，主要有高效液相色谱法(hplc)、超高液相色谱法(uplc)、液相色谱-质谱联用法(lc-ms)、紫外可见光谱法(uv-vis)等。但hplc和uplc存在复杂的基质中抗干扰性较差、设备昂贵、检测器种类少、缺少通用性检测器等缺点，且样品前处理耗时较长；lc-ms效率高、准确性强，但联用仪器价格昂贵，远不如hplc那样普及。紫外可见光谱法易受到其他光学活性添加剂和调味品的干扰，易出现假阳性。而酶联免疫法(elisa)具有灵敏度高、特异性强、操作简单、仪器设备成本较低等优点。

3、目前，国内外关于红2g单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法仅有2篇文献报告。申请公布号为cn 102798713 a的发明专利申请，公开了食品红10(红2g)检测试剂盒及其制备方法，公布了食品红10(红2g)人工抗原的制备，将红2g结构上联苯酚的羟基转化为甲磺酯基，在无水乙醇和液氨的作用下合成能够与蛋白质偶联的半抗原，将半抗原与牛血清白蛋白(bsa)偶联合成人工抗原，该抗原制备的单克隆抗体对红2g的ic50为951.4μg/l，该专利制备的单克隆抗体对红2g的灵敏度较低，且半抗原和人工抗原制备过程较为复杂，时间较长，在合成过程中使用二氯甲烷、液氨等挥发性气体对人体造成伤害。申请公布号为cn114032215 a的发明专利申请，公开了一种分泌红2g单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，公布了一种红2g人工抗原的合成方法，将重氮化的对氨基苯磺酸与1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸直接偶合，使红2g结构上含有羧基，再连接bsa合成人工抗原，用该抗原制备的单克隆抗体对红2g的ic50为2μg/l。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种红2g羧基化产物5-乙酰氨基-3-对苯甲酸偶氮基-4-萘酚-2,7-二磺酸(r2g-cooh)的合成方法，合成步骤简单、有效。

2、本发明还提供一种以r2g-cooh为半抗原制备得到完全抗原，通过免疫小鼠、细胞融合及筛选，从而得到灵敏度高、特异性强的单克隆抗体，对红2g的ic50达到0.1μg/l。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、1、本发明提供一种r2g-cooh的合成方法，具体制备步骤如下：

5、(1)对重氮氨基苯甲酸的合成

6、将对氨基苯甲酸溶于超纯水中，在0～5℃环境下搅拌均匀，加入浓度为30％的盐酸，冷却至4℃，在5～10min内每间隔10s滴加nano2溶液，用刚果红试纸和淀粉碘化钾试纸检测均迅速变为蓝色，表明反应完全，此时液体呈黄色，停止滴加nano2溶液，温度保持0～5℃继续搅拌2h，得到的溶液简称a液，于0～5℃保存备用。

7、(2)1-乙酰氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸的合成

8、将1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸(h酸，灰色粉末)和水混合，20℃搅拌10min，再加入乙酰化催化剂——乙酸酐，升温至30℃，反应30min，变为棕黑色液体，冷却，用na2co3将ph值调至9～10，过滤，得到1-乙酰氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸，简称为b液，于0～5℃备用。

9、(3)r2g-cooh的合成

10、将步骤(1)所得a液于0～5℃、5～10min内加至步骤(2)所得b液中，a液和b液以摩尔比为(1～1.5)∶1时最优，将ph值控制在8左右，0～5℃搅拌1h，反应完毕后，加入氯化钠，加热至65℃，搅拌30min至烧瓶底部无晶体，呈现粘稠状态，降温至30℃，抽滤，收集滤饼。

11、(4)r2g-cooh的纯化

12、将步骤(3)所得滤饼，用热水溶解，加热至65℃，搅拌30min，冷却至40℃后抽滤，收集滤饼，真空干燥过夜后，得到产物r2g-cooh。

13、2、本发明提供r2g-cooh在免疫学领域制备识别红2g的单克隆抗体的应用，通过以下方式进行：

14、(1)将r2g-cooh作为半抗原，与载体蛋白偶联合成免疫原和包被原，免疫原的载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)。免疫原的投料比(r2g-cooh∶bsa)，即摩尔比为100∶1，偶联比为15.5。

15、包被原的载体蛋白为卵清蛋白(ova)，包被原设置不同投料比(r2g-cooh∶ova)为25∶1、50∶1、75∶1、100∶1、125∶1，其中50∶1为最佳投料比，最佳偶联比为15.4。

16、(2)将免疫原以不同剂量小鼠背部皮下注射，首次免疫以免疫剂量为50μg/只和100μg/只两个免疫剂量，将免疫原与弗氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周后加强免疫采用相同免疫剂量与弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射，免疫间隔为2周，第一次加强免疫后6～8天进行断尾采血，通过间接竞争elisa检测小鼠血清效价及特异性，选择效价高、特异性强的小鼠进行细胞融合，研究表明免疫剂量为50μg/只的小鼠血清效价及灵敏度优于100μg/只。

17、(3)细胞融合与筛选：

18、采用聚乙二醇(peg4000)将小鼠免疫脾细胞和sp 2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用hat选择培养基培养杂交瘤细胞，用间接竞争elisa筛选阳性细胞孔，筛选效价最高、抑制效果最佳的细胞孔进行亚克隆，使用ht选择培养基培养，5天后使用间接竞争elisa检测，连续亚克隆4次，获得能够分泌红2g特异性抗体的杂交瘤细胞株2g6(保藏编号cctccno:c2022335)。

19、(5)单克隆抗体的制备：

20、每只小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡进行预处理，间隔7d后，每只小鼠腹腔注射0.5ml对数生长期的杂交瘤细胞悬液1×106cell/ml，间隔7d后，每天观察小鼠腹水产生情况。待小鼠腹部明显膨大时，用酒精棉球对小鼠腹部皮肤消毒后采集腹水。将收集的腹水8000r/min离心10min，去掉表面油层，吸取上清，得到单克隆抗体，加入甘油后混匀并分装，置-20℃保存。

21、本发明相比现有技术具有以下有益效果：

22、1、本发明红2g羧基化产物5-乙酰氨基-3-对苯甲酸偶氮基-4-萘酚-2,7-二磺酸的合成中使用的对氨基苯甲酸、盐酸、nano2、1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸、乙酸酐、氯化钠等均为常用原料及试剂，容易得到。

23、2、本发明红2g羧基化产物5-乙酰氨基-3-对苯甲酸偶氮基-4-萘酚-2,7-二磺酸合成中原料相对安全、毒性作用较小，且对环境污染小。

24、3、本发明红2g羧基化产物5-乙酰氨基-3-对苯甲酸偶氮基-4-萘酚-2,7-二磺酸合成中反应设备、反应条件容易实现，所使用的烧瓶、恒温水浴锅、抽滤瓶、ph计等实验仪器造价低，操作简单。

25、4、本发明合成产物r2g-cooh应用过程中，步骤简单、有效，适用于免疫学分析领域。

26、5、本发明通过不同免疫剂量的筛选，成功免疫小鼠，获得效价高、抑制效果好的小鼠进行细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株2g6(保藏编号cctcc no:c2022335)，该细胞株分泌的单克隆抗体对红2g具有较好的特异性和检测灵敏度(ic50为0.1μg/l)，于免疫学检测方法具有实际应用价值。

27、6、本发明获得的由保藏编号cctcc no:c2022335的杂交瘤细胞株2g6分泌的单克隆抗体对红2g的灵敏度为申请公布号为cn114032215 a发明专利申请的20倍，是申请公布号为cn 102798713a发明专利申请的9514倍(见表1)。

28、表1.本发明与现有技术的对比的积极效果

29、 比较技术 半抗原合成原料 偶联方法 载体蛋白 <![cdata[ic₅₀(μg/l)]]> cn 102798713a 食品红10(红2g) edc bsa/ova 951.4 cn 114032215a 对氨基苯磺酸、1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸 edc bsa/ova 2.0 本发明 对氨基苯甲酸、1-乙酰氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸 edc bsa/ova 0.1