一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法与流程

本发明属于生物医药，涉及一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法。

背景技术：

1、核酸递送作为常见的技术手段，已经广泛地应用于基因治疗、生物制剂生产及研究等场景中。核酸递送载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体在基因递送方面表现较好，但也存在一些缺点，如dna包装能力有限，载体生产困难，以及病毒插入引起的突变、免疫原性失控和炎症反应等安全问题，这些缺点严重限制了其应用。非病毒载体是利用脂质体或阳离子多聚复合物封装核酸(dna和/或rna分子)形成纳米复合物，它们可以自发地压缩核酸分子，保护不被dnase/rnase降解，并且产生的纳米复合物可以通过内吞/吞噬途径或直接融合/穿透细胞质膜进入细胞。非病毒载体具有较低的免疫原性，有可能克服病毒载体的许多限制，特别是安全性问题。

2、目前最为常见的核酸递送载体主要有一下几类：脂质体(包括普通双层阳离子脂质、脂质体dotap、polyplus、lipofectamine、lipofectine等)、阳离子多聚复合物[如聚乙烯亚胺(pei)、聚酰胺-胺(pamam)等)]、树枝状高聚物(den)和各类多聚物的微粒体(如聚氰基丙烯酸酯纳米粒、聚乳酸纳米粒等)、基于特异性受体的配体介导的核酸分子靶向递送系统和多肽蛋白类递送载体以及利用唾液酸蛋白、多糖、表皮生长因子、叶酸、转铁蛋白、甾体激素、单克隆抗体等靶向分子修饰而具有主动靶向作用的纳米粒。

3、阳离子脂质体有着很好的转染效率，但是价格非常昂贵，且具有高度的细胞毒性；而与阳离子脂质体相比，阳离子聚合物的转染效率高，价格更低，但细胞毒性较强。自1995年以来，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)成为体内外递送核酸应用最广泛的阳离子聚合物，其分子量，聚合度，分子大小，以及配置方法等均可影响转染效率，其中25kda的pei溶液是使用最广泛的阳离子聚合物转染试剂。

4、pei递送核酸的优点是能够结合和保护核酸分子，并为核内体逃逸提供质子缓冲能力。然而，当利用pei的高分子量或高n/p比(n为pei中游离的氨基，p为dna/rna中的磷酸基团，n/p指两者的摩尔数之比)将核酸传递到哺乳动物细胞时，由于其阳离子性质和质子海绵效应，能够避免被内体降解，使pei具有较高的细胞毒性。为了解决这一问题，一般采用的方法包括：使用相对低分子量的pei，如分子量在25kda左右的pei，或修饰pei(如偶联peg)。前者仍具一定毒性，后者合成难度增加，成本更高。

技术实现思路

1、除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。本发明中未作具体说明的实验方法，均根据《分子克隆实验指南》(第四版)j.萨姆布鲁克一书中具体方法进行，或者按照相关产品说明书进行。本发明中所用生物试剂，无特殊说明，均可以从商业途径获得。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。

2、本发明提供了一种使用游离氨基酸增强聚乙烯亚胺递送核酸效率的方法，能够在不增加细胞毒性的前提下显著提高聚乙烯亚胺的转染效率。该方法简单易行，安全性高，成本低。

3、在一个方面，本发明提供了一种向细胞递送核酸的方法，包括：在存在游离氨基酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触，其中所述氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸中的一或多种，优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。

4、如本文所用，“游离氨基酸”是指在pei、要递送的核酸和细胞进行接触的介质中，所述氨基酸以游离状态存在。本文提及氨基酸时，除非明确排除或者根据上下文可以排除，否则包括酸及其在介质中可溶的盐的形式，例如包括但不限于钠、钾、镁盐。在一些实施方案中，本文所述介质是水性介质，例如用于细胞核酸转染的溶液或培养基。

5、在一个实施方案中，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种，优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

6、所述氨基酸在所述介质中的浓度可以由本领域技术人员容易地确定。在一个实施方案中，所述氨基酸在所述介质中的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

7、如本文所用，“核酸”是指通过3’-5’-磷酸二酯键连接而成的核苷酸聚合物，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。所述核酸包括单链或双链形式的、线形或环形的由核糖核苷酸(腺嘌呤核糖核苷酸(a)、鸟嘌呤核糖核苷酸(g)、胞嘧啶核糖核苷酸(c)、尿嘧啶核糖核苷酸(u))组成的核糖核酸(rna)和由脱氧核糖核苷酸(脱氧腺嘌呤核糖核苷酸(a)、脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸(g)、脱氧胞嘧啶核糖核苷酸(c)、脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸(t))组成的脱氧核糖核酸(dna)。所述核酸可以包括任何所需的修饰，例如甲基化、硫代、糖基化等。

8、本文中，所述要递送的核酸是指需要转移进入靶细胞的核酸，例如包含转基因的构建体例如表达载体或用于基因重组的转移载体等。

9、在一个实施方案中，所述核酸包括dna和/或rna。在一个实施方案中，当所述核酸是dna时，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种，优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。在一个实施方案中，当所述核酸是rna时，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种。在一个实施方案中，所述dna包括质粒dna。在一个实施方案中，所述rna包括mrna。

10、如本文所用，“递送”是指以pei作为递送载体，使所需核酸通过细胞膜进入细胞质或者进入细胞核的过程。本领域已知使用pei作为递送载体向细胞递送核酸的条件、步骤和所需常规试剂。

11、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。

12、在一个实施方案中，当在水性介质中进行递送且所述核酸是dna时，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

13、在一个实施方案中，当在水性介质中进行递送且所述核酸是rna时，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

14、如本文所用，“细胞”是可以向其中递送核酸的任何细胞，包括原代细胞或细胞系。本领域已知众多可以进行核酸递送的细胞，例如包括但不限于真核细胞，如动物(如非人哺乳动物)、昆虫细胞。

15、在一个实施方案中，所述细胞是人类细胞或细胞系，包括例如所述细胞选自真核细胞，如动物(如非人哺乳动物)、昆虫细胞、人类细胞或细胞系，例如hek-293细胞(atcc编号：ccl-1573)及其衍生株，如hek-293t细胞(atcc编号：crl-3216)、n2a细胞(neuro-2a，atcc编号：ccl-131)和cho细胞(atcc编号：ccl-61)及其衍生株。

16、在一个实施方案中，所述细胞在所述游离氨基酸的存在下，用所述pei和要递送的核酸转染不超过48小时，例如不超过36小时，不超过24小时，不超过12小时，优选不超过24小时。

17、用于核酸递送的细胞在进行核酸递送前，培养细胞至适当的铺满密度，例如铺满密度为70％-80％。用于特定细胞的培养条件、培养基以及添加剂等是本领域熟知的。

18、如本文所用，“聚乙烯亚胺”(pei，cas：9002-98-6)是本领域已知用于核酸递送的阳离子聚合物。pei分子结构中含有伯胺、仲胺、叔胺等基因，具有较高的化学反应性。

19、在一个实施方案中，本文所述的pei的平均分子量(重均分子量)为约20-30kda，例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30kda，优选约25kda。特别地，所述重均分子量例如是通过ls方法测量的。

20、在一个实施方案中，本文所述的pei的平均分子量(数均分子量)为约8-12kda，例如约8、9、10、11或12kda，优选约10kda。特别地，所述数均分子量例如是通过gpc方法测量的。

21、如本文所用，“接触”是指提及的物质的物理性接触，例如所述游离氨基酸、pei、要递送的核酸和细胞处于同一介质如水性溶液或培养基中，从而可以互相接触。

22、本文中，在核酸递送体系中，要递送的核酸与pei的比例可以根据本领域技术知识调整，例如重量比可以为约1:5至约5:1，如约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1，优选为约1:1。

23、本文中，在核酸递送体系中，所述游离氨基酸以约1-25mmol/l的浓度存在，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

24、在一个实施方案中，用于递送核酸的溶液中，要递送的核酸：存在的游离氨基酸：pei的比例为1μg的核酸：0.5-2×10-2mmol的氨基酸：1-3μg的pei。

25、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸的方法，包括：将pei、要递送的核酸和本发明所述的游离氨基酸混合，之后加入细胞，以将所述核酸递送到所述细胞中。

26、在一个实施方案中，本发明提供了一种使用游离氨基酸增强pei递送核酸的方法，包括在pei和要递送的核酸混合液中添加一定浓度的氨基酸(如递送dna时，优选氨基酸为组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、和/或苏氨酸；递送rna时，优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和/或苏氨酸)，优选预混20-40分钟后，加入细胞培养液进行转染以将核酸递送到细胞中。

27、在进一步的实施方案中，本发明提供一种使用游离氨基酸提高pei递送核酸效率的方法，包括：

28、(1)将细胞(如hek-293t细胞、n2a细胞或cho细胞)培养细胞至适当的铺满密度，例如铺满密度为70％-80％和/或贴壁后24小时内进行如下操作；

29、(2)将氨基酸、pei、要递送的核酸混匀，室温静置一段时间，例如20-40分钟；

30、(3)移除细胞培养基，然后加入等体积新鲜培养基以及步骤(2)得到的混匀的溶液，继续培养24小时或48小时。

31、在一个方面，本发明提供了一种向细胞递送dna的方法，包括：在存在游离氨基酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的dna与所述细胞接触，其中所述氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸中的一或多种，优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种，更优选选自甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一或多种。

32、在一个实施方案中，所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

33、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中进行递送且所述核酸是dna时，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

34、在一个实施方案中，所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约2.5-20mmol/l，更优选为约10mmol/l。

35、在一个实施方案中，所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约2.5-20mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约20mmol/l。

36、在一个实施方案中，所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约20mmol/l。

37、在一个实施方案中，所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约20mmol/l。

38、在一个实施方案中，所述丝氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

39、在一个实施方案中，所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

40、在一个实施方案中，所述精氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约20mmol/l。

41、在一个实施方案中，所述赖氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5-25mmol/l，更优选为约20mmol/l。

42、在一个实施方案中，所述细胞是hek-293t细胞。在一个实施方案中，所述细胞在选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种游离氨基酸的存在下，用所述pei和要递送的dna进行转染。

43、在一个实施方案中，所述细胞是n2a细胞及其衍生株，并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种，优选苏氨酸。优选地，所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

44、在一个实施方案中，所述细胞是cho细胞及其衍生株，并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种，优选甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一或多种。优选地，所述甘氨酸、丙氨酸和/或苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

45、在一个方面，本发明提供了一种向细胞递送rna的方法，包括：在存在游离氨基酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的rna与所述细胞接触，其中所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种，优选选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种，更优选选自甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸中的一或多种。

46、在一个实施方案中，所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

47、在一个实施方案中，所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5-10mmol/l，更优选为约5mmol/l。

48、在一个实施方案中，所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约1.25或5mmol/l。

49、在一个实施方案中，所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5-20mmol/l，更优选为约5或20mmol/l，最优选为约5mmol/l。

50、在一个实施方案中，所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约2.5-20mmol/l，更优选为约5或10mmol/l，最优选为约10mmol/l。

51、在一个实施方案中，所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约1-20或2.5-10mmol/l，更优选为约2.5或5mmol/l。

52、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中进行递送且所述核酸是rna时，优选地，所述氨基酸选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

53、在一个实施方案中，所述细胞选自真核细胞，如动物(如非人哺乳动物)、昆虫细胞、人类细胞或细胞系，例如hek-293细胞(atcc编号：ccl-1573)及其衍生株，如hek-293t细胞(atcc编号：crl-3216)、n2a细胞(neuro-2a，atcc编号：ccl-131)和cho细胞(atcc编号：ccl-61)及其衍生株。

54、在一个实施方案中，所述细胞是hek-293t细胞。在一个实施方案中，所述细胞在选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的一或多种游离氨基酸的存在下，用所述pei和要递送的rna进行转染。优选地，所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约1.25、2.5、5、10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

55、在一个实施方案中，所述细胞是n2a细胞及其衍生株，并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一或多种，优选组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸。优选地，所述氨基酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

56、在一个实施方案中，所述细胞是cho细胞及其衍生株，并且其中所述游离氨基酸是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸中的一或多种，优选甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸中的一或多种。优选地，所述甘氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

57、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸组氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

58、在一个实施方案中，所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

59、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自组氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

60、在一个实施方案中，当所述核酸是dna时，所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约2.5-20mmol/l，更优选为约10mmol/l。

61、在一个实施方案中，当所述核酸是rna时，所述组氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5-10mmol/l，更优选为约5mmol/l。

62、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸dna的方法，包括：在存在游离氨基酸赖氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的dna与所述细胞接触。

63、在一个实施方案中，所述赖氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5-25mmol/l，更优选为约20mmol/l。

64、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸dna时，所述氨基酸选自赖氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

65、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸甘氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

66、在一个实施方案中，所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，优选为约5、10或20mmol/l。

67、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自甘氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

68、在一个实施方案中，当所述核酸是dna时，所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约2.5-20mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约20mmol/l。

69、在一个实施方案中，当所述核酸是rna时，所述甘氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5mmol/l。

70、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸dna的方法，包括：在存在游离氨基酸精氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的dna与所述细胞接触。

71、在一个实施方案中，所述精氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约20mmol/l。

72、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸dna时，所述氨基酸选自精氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

73、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸丙氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

74、在一个实施方案中，所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，优选为约5、10或20mmol/l。

75、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自丙氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

76、在一个实施方案中，当所述核酸是dna时，所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约20mmol/l。

77、在一个实施方案中，当所述核酸是rna时，所述丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约5-20mmol/l，更优选为约5或20mmol/l，最优选为约5mmol/l。

78、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸脯氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

79、在一个实施方案中，所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，优选为约5、10或20mmol/l。

80、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自脯氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

81、在一个实施方案中，当所述核酸是dna时，所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约20mmol/l。

82、在一个实施方案中，当所述核酸是rna时，所述脯氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约2.5-20mmol/l，更优选为约5或10mmol/l，最优选为约10mmol/l。

83、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸亮氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

84、在一个实施方案中，所述亮氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

85、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自亮氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

86、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸谷氨酰胺的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

87、在一个实施方案中，所述谷氨酰胺存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

88、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自谷氨酰胺和其水可溶性盐中的一或多种。

89、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸异亮氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

90、在一个实施方案中，所述异亮氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

91、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自异亮氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

92、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸苯丙氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

93、在一个实施方案中，所述苯丙氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

94、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自苯丙氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

95、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸甲硫氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

96、在一个实施方案中，所述甲硫氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

97、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自甲硫氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

98、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸酪氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

99、在一个实施方案中，所述酪氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

100、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自酪氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

101、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸半胱氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

102、在一个实施方案中，所述半胱氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

103、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自半胱氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

104、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸dna的方法，包括：在存在游离氨基酸丝氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的dna与所述细胞接触。

105、在一个实施方案中，所述丝氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

106、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸dna时，所述氨基酸选自丝氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

107、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸色氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

108、在一个实施方案中，所述色氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，如为约5、10或20mmol/l。

109、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自色氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

110、在一个实施方案中，本发明提供了一种向细胞递送核酸(例如dna或rna)的方法，包括：在存在游离氨基酸苏氨酸的条件下，将聚乙烯亚胺、要递送的核酸与所述细胞接触。

111、在一个实施方案中，所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-15、1.25-15、2-15、2.5-15、3-15、4-15、5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，例如为约2.5-20或5-10mmol/l，优选为约5、10或20mmol/l。

112、在一个实施方案中，所述递送是在水性介质例如溶液或培养基中进行的。在一个实施方案中，当在水性介质中递送所述核酸时，所述氨基酸选自苏氨酸和其水可溶性盐中的一或多种。

113、在一个实施方案中，当所述核酸是dna时，所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、10-20、1-10、1.25-10、2-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约10-25mmol/l，更优选为约10或20mmol/l，最优选为约10mmol/l。

114、在一个实施方案中，当所述核酸是rna时，所述苏氨酸存在的浓度为约1-25mmol/l，例如约1-25、1.25-25、2-25、2.5-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、1-20、1.25-20、2-20、2.5-20、3-20、4-20、5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、1-10、1.25-10、2.5-10、3-10、4-10或5-10mmol/l，优选为约1-20或2.5-10mmol/l，更优选为约2.5或5mmol/l。

115、本发明的方法使用的氨基酸是一种天然存在的生物安全性较好的物质，且带有电荷，其通过参与pei与核酸的结合，可降低转染过程中pei的使用量和n/p(n为pei中游离的氨基，p为dna/rna中的磷酸基团，n/p指两者的摩尔数之比)，并明显增强pei的转染效果。

116、本发明的有益效果在于，利用本发明的改进的基于聚乙烯亚胺的核酸递送方法，能够在不增加细胞毒性的前提下显著提高聚乙烯亚胺的转染效率。该方法简单易行，安全性高，成本低。