抗LILRB1/LILRB2的全人源单域抗体及其应用

本发明属于生物技术，具体涉及到一种抗lilrb1/lilrb2的全人源单域抗体及其应用。

背景技术：

1、纳米抗体是分子量最小的抗体，在骆驼血液中发现。骆驼来源的纳米抗体体积小，穿透能力强，抗原特异性好，但是由于免疫原性易引起相关安全问题。从人体血液构建全人源单域抗体库，筛选全人源单域抗体可以有效降低免疫原性问题。

2、白细胞免疫球蛋白样受体b1(the leukocyte ig-like receptor subfamily b2，lilrb1)，又名ilt2或cd85j，是白细胞免疫球蛋白样受体lilr家族的免疫抑制成员。其在细胞例如b细胞、t细胞、nk细胞、树突细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞中表达。lilrb1通过结合经典和非经典mhc i类而参与抑制免疫细胞活性的信号转导机制。同时，据报道，各种癌细胞过表达mhc i类如hla-g以进行免疫逃逸。预期阻断lilrb1与hla-g的结合使其恢复受抑制的免疫细胞活性，从而表现出抗癌作用。

3、白细胞免疫球蛋白样受体b2(the leukocyte ig-like receptor subfamily b2，lilrb2)，又名ilt4或mir-10和cd85d，是白细胞免疫球蛋白样受体lilr家族的免疫抑制成员，调节免疫细胞的活化。在生理学上，通常在许多髓系细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(tam)高表达lilrb2，lilrb2最主要的配体是hla-g，相关研究表明lilrb2/hla-g结合会激活akt磷酸化和stat6活化，与m2巨噬细胞极化相关。pir-b是lilrb2的小鼠同源物，研究表明pir-b是维持小鼠髓系抑制性细胞(mdsc)m2表型的关键性靶点，在pir-b缺陷小鼠体内tlr和ifn-γ信号在mdsc中放大，il-4/il-13和il-10表达被抑制，小鼠肿瘤负荷减少，treg活化减少。lilrb2主要表达在髓系细胞中，不在b、nk细胞中表达，在其他组织中表达有限，lilrb2是一种有前途针对m2型巨噬细胞的免疫检查点，具有免疫前景和治疗价值。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供抗lilrb1/lilrb2全人源单域抗体。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述抗体的氨基酸序列如seqid no:1～5所示，编码所述抗体的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:6～10所示。

5、作为本发明所述抗lilrb1/lilrb2全人源单域抗体的一种优选方案，其中：所述抗体能够靶向结合lilrb1、lilrb2分子。

6、作为本发明所述抗lilrb1/lilrb2全人源单域抗体的一种优选方案，其中：所述抗体能够阻断lilrb1、lilrb2与其配体hla-g的结合。

7、本发明还提供了一种编码如权利要求1所述抗lilrb1/lilrb2全人源单域抗体的制备方法，包括，

8、以重组人lilrb2生物素标签蛋白和噬菌体展示抗体库为起始材料，通过链霉亲和素与生物素之间的互作将lilrb2固定在磁珠上，用抗体库与其孵育；

9、孵育后洗去未结合/结合弱的噬菌体，洗脱与lilrb2蛋白结合的噬菌体，反复3次，每次改变lilrb2生物素标签蛋白的使用量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体，保留结合强的噬菌体；

10、用强结合的噬菌体侵染宿主菌，涂板并过夜培养，获得单克隆菌落，并进行单克隆化；

11、利用单克隆培养上清进行elisa筛选得到单克隆抗体基因，并对单克隆进行核酸序列测定；

12、将信号肽、抗体基因、人源igg4 ec的编码序列连接，同框阅读，构建质粒，质粒转染获得获得抗体；

13、转染293f细胞，振荡培养收获上清，利用proteina磁珠亲和层析从中纯化获得融合蛋白。

14、本发明还提供了一种质粒，包含上述核酸分子。

15、本发明还提供了一种表达载体，包含上述抗体基因，与信号肽，人源igg4的fc的编码序列连接。

16、本发明还提供了一种融合蛋白，包含上述抗体分子，与异源蛋白融合，其中，所述异源蛋白为人igg4的fc。

17、本发明还提供了一种偶联物，包含上述抗体，或融合蛋白，与一种效应分子偶联，其中，所述效应分子为可检测标记，包括荧光标记、放射性标记、亲和素、生物素、酶。

18、本发明所述的抗体能够应用于制备遏制肿瘤微环境对免疫检查点抑制剂耐药的药物或药物组合物。

19、本发明所述抗体能够应用于改善肿瘤微环境，逆转tam介导的肿瘤免疫抑制。

20、为了能更彻底的理解本发明，以下列出一些定义，包括，

21、本文中的“抗lilrb1/lilrb2全人源单域抗体”意指既能够与lilrb2结合也能与lilrb1结合的抗体。

22、本文中使用的“全人源”意指抗体全部由人类抗体基因所编码。

23、本文中使用的“融合蛋白”意指融合基因的表达产物，或通过生物学或化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。

24、本文中使用的“偶联物”意指抗体或蛋白质分子通过生物或化学方法与另一小分子或大分子连接。

25、本发明以商品化的重组人lilrb2生物素标签蛋白和噬菌体展示抗体库为起始材料，将lilrb2生物素标签蛋白与链霉亲和素包被磁珠共孵育，通过链霉亲和素与生物素之间的互作将lilrb2固定在磁珠上，用抗体库与其孵育，洗去未结合/结合弱的噬菌体，将与lilrb2蛋白结合的噬菌体洗脱下来；

26、如此反复3次，每次改变lilrb2生物素标签蛋白的使用量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体并尽可能保留更多的结合强的噬菌体。用强结合的噬菌体侵染宿主菌，涂板并过夜培养，获得单克隆菌落，即将可结合lilrb2的噬菌体抗体进行单克隆化，利用单克隆培养上清进行elisa筛选，并对单克隆进行核酸序列测定。

27、进一步的，将信号肽、抗体基因、人源igg4 fc的编码序列连接，同框阅读，构建哺乳动物表达载体。转染293f细胞，振荡培养5天后收获上清，利用蛋白a磁珠亲和层析从上清中纯化获得融合蛋白；

28、将纯化抗体进行分子阻断实验，将hla-g四聚体作为包被底物，纯化抗体与带有小鼠fc标签的lilrb2蛋白共同加到elisa包被板内，使用抗小鼠二抗作为酶标二抗，加入显色液显色分析结果。

29、将纯化抗体与lilrb2超表达细胞系结合，使用流式细胞术的方法检测结合情况；将lilrb1蛋白作为包被底物，纯化抗体加到包被板内，使用抗人二抗作为酶标二抗，加入显色液分析结果，证明了本发明抗lilrb1/lilrb2的全人源单域抗体的有效性。

30、本发明有益效果：

31、本发明提供了抗lilrb1/lilrb2的全人源单域抗体，该抗体具有阻断hla-g配体功能、同时可结合细胞表面人源lilrb1和lilrb2蛋白，能够应用于强化肿瘤环境中存在的m1型巨噬细胞的功效，弱化m2型巨噬细胞的抑制能力，改善肿瘤微环境，逆转tam介导的肿瘤免疫抑制。