与CD19结合的重链抗体的制作方法

本发明涉及与cd19结合的人重链抗体(例如，uniabstm)。本发明还涉及制备此类抗体的方法；包含此类抗体的组合物，包括药物组合物；及其在治疗以cd19表达为特征的b细胞病症中的用途。

背景技术：

1、cd19

2、cd19，也称为b淋巴细胞表面抗原b4(uniprot p15391)，是在所有人b细胞上表达但未在浆细胞上发现的细胞表面受体。cd19是一种跨膜蛋白，其可将胞质信号传导蛋白募集到膜上，并在cd19/cd21复合物内发挥作用，以降低b细胞受体信号传导通路的阈值。cd19具有相对较大的240个氨基酸的胞质尾。细胞外ig样结构域被潜在的二硫键连接的非ig样结构域和n连接的碳水化合物加成位点分开。胞质尾在c末端附近含有至少九个酪氨酸残基，其中一些残基已被磷酸化。与cd20和cd22一起，cd19对b细胞谱系的限制性表达使其成为治疗b细胞恶性肿瘤的有吸引力的靶标。已经描述了许多对cd19特异的单克隆抗体和抗体药物缀合物(例如，naddafi等人2015，pmc4644525)。另外，抗cd19嵌合抗原受体t细胞已被批准用于治疗白血病(例如，sadelain等人2017，pmid：29245005)。

3、重链抗体

4、在常规igg抗体中，重链和轻链的缔合部分归因于轻链恒定区与重链的ch1恒定结构域之间的疏水相互作用。重链框架2(fr2)和框架4(fr4)区域中还有其他残基，它们也有助于重链与轻链之间的这种疏水相互作用。

5、然而，已知的是，骆驼科动物(胼足亚目，包括骆驼、单峰骆驼和美洲驼)的血清含有仅由成对的h链组成的主要抗体类型(仅重链抗体或uniabstm)。骆驼科(camelidae)(单峰骆驼(camelus dromedarius)、双峰骆驼(camelus bactrianus)、大羊驼(lama glama)、原驼(lama guanaco)、羊驼(lama alpaca)和小羊驼(lama vicugna))的uniabstm具有由单个可变结构域(vhh)、一个铰链区和两个恒定结构域(ch2和ch3)组成的独特结构，所述恒定结构域与经典抗体的ch2和ch3结构域高度同源。这些uniabstm缺少恒定区(ch1)的第一结构域，其存在于基因组中，但在mrna加工过程中被剪除。ch1结构域的缺失解释了uniabstm中轻链的缺失，因为此结构域是轻链的恒定结构域的锚定位置。此类uniabstm天然演化以通过来自常规抗体或其片段的三个cdr来赋予抗原结合特异性和高亲和力(muyldermans，2001；jbiotechnol 74：277-302；revets等人，2005；expert opin biol ther 5：111-124)。软骨鱼(诸如鲨鱼)也已经演化出一种独特类型的免疫球蛋白，称为ignar，它缺少轻多肽链，并且完全由重链组成。ignar分子可通过分子工程化进行操纵以产生单个重链多肽的可变结构域(vnar)(nuttall等人eur.j.biochem.270，3543-3554(2003)；nuttall等人function andbioinformatics 55，187-197(2004)；dooley等人，molecular immunology 40，25-33(2003))。

6、缺乏轻链的仅重链抗体结合抗原的能力于20世纪60年代确定(jaton等人(1968)biochemistry，7，4185-4195)。与轻链物理分离的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留了80％的抗原结合活性。sitia等人(1990)cell，60，781-790证明，在哺乳动物细胞培养中，从重排的小鼠μ基因中除去ch1结构域导致产生仅重链无轻链的抗体。产生的抗体保留了vh结合特异性和效应子功能。

7、可通过免疫作用产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(vander linden，r.h.，等人biochim.biophys.acta.1431，37-46(1999))，并且vhh部分可容易地在酵母中克隆和表达(frenken，l.g.j.，等人j.biotechnol.78，11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典的f(ab)或fv片段(ghahroudi，m.a.等人febslett.414，521-526(1997))。

8、其中λ轻(l)链基因座和/或λ和κl链基因座已被功能性沉默的小鼠，和由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利号7,541,513和8,367,888中。在小鼠和大鼠中重组产生仅重链抗体报道于例如，wo2006008548；美国申请公布号20100122358；nguyen等人，2003，immunology；109(1)，93-101；brüggemann等人，crit.rev.immunol.；2006，26(5)：377-90；以及zou等人，2007，j exp med；204(13)：3271-3283中。通过锌指核酸酶的胚胎显微注射产生基因敲除的大鼠描述于geurts等人，2009，science，325(5939)：433中。可溶性仅重链抗体和包含产生此类抗体的异源重链基因座的转基因啮齿动物描述于美国专利号8,883,150和9,365,655中。包含单结构域抗体作为结合(靶向)结构域的car-t结构描述于例如iri-sofla等人.，2011，experimental cell research 317：2630-2641以及jamnani等人.，2014，biochim biophys acta，1840：378-386中。

技术实现思路

1、本发明的方面涉及对cd19具有结合亲和力的重链抗体，包括但不限于uniabstm。本发明的其他方面涉及制备此类抗体的方法，包含此类抗体的组合物，及其在治疗以cd19表达为特征的b细胞病症中的用途。

2、在一些实施方案中，与cd19结合的仅重链抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)在seq id no：1至6的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的cdr1；和/或(b)在seq id no：7至12的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的cdr2；和/或(c)在seq idno：13的氨基酸序列中具有两个或更少取代的cdr3。在一些实施方案中，cdr1、cdr2和cdr3序列存在于人框架中。在一些实施方案中，仅重链抗体在不存在ch1序列的情况下还包含重链恒定区序列。

3、在一些实施方案中，仅重链抗体包含：(a)选自由seq id no：1至6组成的组的cdr1序列；和/或(b)选自由seq id no：7至12组成的组的cdr2序列；和/或(c)seq id no：13的cdr3序列。在一些实施方案中，仅重链抗体包含：(a)选自由seq id no：1至6组成的组的cdr1序列；和(b)选自由seq id no：7至12组成的组的cdr2序列；和(c)seq id no：13的cdr3序列。

4、在一些实施方案中，仅重链抗体包含：(a)seq id no：4的cdr1序列、seq id no：10的cdr2序列和seq id no：13的cdr3序列。在一些实施方案中，仅重链抗体包含与seq idno：14至21的任一序列具有至少95％的序列同一性的重链可变区。在一些实施方案中，仅重链抗体包含选自由seq id no：14至21组成的组的重链可变区序列。在一些实施方案中，仅重链抗体包含seq id no：17的重链可变区序列。

5、在一些实施方案中，与cd19结合的仅重链抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含(a)具有下式的cdr1序列：

6、g f x1 f s x2 x3 w(seq id no：22)

7、其中x1为t或s；x2为s或n；x3为y或f；和(b)具有下式的cdr2序列：

8、x4 x5 x6 x7 g s x8 x9(seq id no：23)

9、其中x4为i或m；x5为n、s或k；x6为q或k；x7为d或a；x8为d或e；x9为k或e；和(c)asgvysfdy(seq id no：13)的cdr3序列。

10、在一些实施方案中，与cd19结合的仅重链抗体包含重链可变区，所述重链可变区在人vh框架中包含cdr1、cdr2和cdr3序列，其中所述cdr序列是在选自由seq id no：1-13组成的组的cdr序列中具有两个或更少取代的序列。

11、在一些实施方案中，仅重链抗体包含重链可变区，所述重链可变区在人vh框架中包含cdr1、cdr2和cdr3序列，其中所述cdr序列选自由seq id no：1-13组成的组。

12、在一些实施方案中，与cd19结合的仅重链抗体包含重链可变区，所述重链可变区在人vh框架中包含：(a)seq id no：4的cdr1序列、seq id no：10的cdr2序列和seq id no：13的cdr3序列。

13、在一些实施方案中，仅重链抗体是多特异性的。在一些实施方案中，仅重链抗体是双特异性的。在一些实施方案中，仅重链抗体对两种不同的cd19蛋白具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅重链抗体对同一cd19蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅重链的抗体对效应细胞具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅重链抗体对t细胞抗原具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅重链抗体对cd3具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅重链抗体为car-t形式。

14、本发明的方面涉及包含本文所述的仅重链抗体的药物组合物。

15、本发明的方面涉及用于治疗以cd1 9表达为特征的b细胞病症的方法，其包括向患有所述病症的受试者施用本文所述的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。在一些实施方案中，所述病症是急性淋巴母细胞性白血病(all)。在一些实施方案中，所述病症是非霍奇金淋巴瘤(nhl)。在一些实施方案中，所述病症是系统性红斑狼疮(sle)。在一些实施方案中，所述病症是类风湿关节炎(ra)。在一些实施方案中，所述病症是多发性硬化症(ms)。

16、本发明的方面涉及编码本文所述的抗体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体和包含此类载体的细胞。

17、本发明的方面涉及产生本文所述的抗体的方法，所述方法包括在允许所述抗体表达的条件下生长本文所述的细胞，以及从所述细胞和/或所述细胞在其中生长的细胞培养基中分离所述抗体。

18、本发明的方面涉及制备本文所述的抗体的方法，所述方法包括用cd19免疫unirat动物以及鉴定结合cd19的重链序列。

19、本发明的方面涉及治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的抗体或药物组合物。

20、本发明的方面涉及如本文所述的抗体或药物组合物在制备用于治疗有需要的个体中的疾病或病症的药物中的用途。

21、本发明的方面涉及一种用于治疗有需要的个体中的疾病或病症的试剂盒，其包含如本文所述的抗体或药物组合物以及使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含至少一种另外的试剂。在一些实施方案中，所述至少一种另外的试剂包括化学治疗药物。

22、这些和其他方面将在本公开的其余部分(包括实施例)中进一步解释。