一种广谱抗牛科病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及动物疫苗领域，特别是一种广谱抗牛科病毒性腹泻病毒的mrna疫苗及其应用。

背景技术：

1、牛科病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, bvdv，又称牛病毒性腹泻病毒）是引起牛病毒性腹泻的主要病原体，其广泛存在于野生和家养的反刍动物身体中。bvdv归属于瘟病毒属，黄病毒科。临床上bvdv主要引起腹泻、繁殖障碍、免疫抑制和粘膜糜烂坏死等症状。该病毒在世界范围内广泛存在，给养殖业带来了较大的损失。尤其是bvdv可在牛群中广泛持续的存在和传播，严重影响牛的生产能力，导致产奶量下降、乳品质下降、生长迟缓和发育不良等。

2、bvdv主要有两种基因型，分别是bvdv1和bvdv2。其中bvdv1是经典毒株，包含bvdv1a、bvdv 1b、bvdv 1e、bvdv 1g、bvdv 1h等基因亚型。bvdv1主要引起腹泻，在临床上检出率明显高于bvdv2。bvdv2同样能够引起腹泻，但bvdv2的毒力更强，可引起成年牛急性发病，血小板减少，发生出血综合症等症状。

3、当前，我国分离到的毒株主要为bvdv1a基因亚型、bvdv1b基因亚型和bvdv2基因型。目前市场上疫苗大多数针对bvdv1a和bvdv1b，但总体效价偏低且保护范围有限，另外尚没有针对bvdv2基因型效果较好的疫苗，且1型对2型交叉保护较弱，无法抵抗强毒力病毒的感染。bvdv为单股正链rna，共编码4种结构蛋白（分别为c、e0、e1和e2）和8种非结构蛋白（分别为npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b）。e2蛋白为bvdv重要的结构蛋白，含有主要的抗原决定簇，免疫原性强，能诱导中和抗体产生，可有效预防bvdv的感染。研究发现，e2蛋白在bvdv1和bvdv2之间的同源性偏低，导致单价e2疫苗只能预防同型的bvdv毒株。e2蛋白胞外域部分主要划分为三个结构域，其中结构域i-ii暴露于病毒表面。因此，开发能同时预防bvdv1型和2型的多价疫苗对于防控牛病毒性腹泻疾病显得尤为重要。

4、现有技术中已公开了多种bvdv疫苗。专利文献cn115381935a（公开日期2022年11月25日）公开了制备bvdv灭活疫苗的方法，包括如下步骤：将bvdv毒株病毒液与过氧化氢溶液混合至过氧化氢的浓度为1％-3％，灭活，得bvdv毒株灭活病毒液，将bvdv毒株灭活病毒液与弗氏佐剂混合，乳化得bvdv灭活疫苗。专利文献cn110331155b（公开日期2022年5月13日）公开了一种携带2型bvdv-erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。利用分子克隆及反向遗传方法，将bvdv2-890#毒株的erns基因和csfv流行毒株qz14的e2基因vr1区置换csfv-c株相应的基因片段，并引入7个特定的突变位点，得到了重组病毒rc-marker2。获得的重组病毒带有分子标记(bvdv2 erns)，猪瘟病毒2型流行毒株的vr1以及特定的突变位点。然而，灭活疫苗的缺点主要包括免疫效果持续时间短、接种时间相对较长且需要多次接种,以及存在一定的不良反应。重组基因疫苗的缺点是存在安全性问题，不能完全排除少数质粒dna插入到染色体上引起突变的可能性，此外会有免疫耐受问题，基因疫苗体内持续产生抗原蛋白，可能打破机体本身的免疫平衡，引发免疫耐受。

5、灭活疫苗、重组蛋白疫苗生产周期长，工艺复杂无法应对突发性大规模流行病的大规模接种需要。mrna则是一种应对爆发性疫情的快速反应疫苗开发平台。近年来，国内外一些公司开发的mrna（信使核糖核酸）疫苗启动临床试验，提供了mrna疫苗的安全性和有效性的前期数据。mrna疫苗是利用线性化的质粒dna为模板，在体外进行酶转录反应合成的，该合成策略避免了活细胞培养生产方式，需要考虑的安全性以及复杂的生产工艺等问题。mrna疫苗平台具有安全，有效，生产周期短，工艺简洁的特点，因而特别适合应对爆发性疫情。本领域已知，mrna翻译快速，起效快，本身具有激活免疫反应的作用；同时，mrna药物生产简单、易于改造、合成快速、成本较低；更重要的是，mrna药物不局限于分裂细胞，没有整合到宿主基因组中的风险，且会在体内自动降解。所以，mrna疫苗的开发具有很大的优势。然而，未检索到有效用于bvdv防治的多价mrna疫苗。本领域亟需一种可同时表达多种bvdv基因型的融合蛋白多价抗原bvdv mrna疫苗，具有强免疫原性，且能够预防或治疗由多种bvdv基因型毒株所造成的感染，从而有效防控牛病毒性腹泻疾病，降低农牧业的损失。

技术实现思路

1、为了克服现有技术bvdv灭活疫苗、重组蛋白疫苗、重组基因疫苗等的缺陷，本发明提供一种同时表达bvdv1a、bvdv1b和bvdv2三种bvdv基因型的e2蛋白结构域i-ii的串联抗原融合蛋白、编码其的核酸和mrna、包含所述mrna的三价bvdv疫苗，以及相关制备方法和应用等。相对于单独表达一种bvdv基因型的e2蛋白的策略，本发明提供更有效的针对多种基因型bvdv毒株的三价bvdv mrna疫苗，是更有利于产业应用的抗原选择策略。此外本发明的抗原融合蛋白融合了助溶助分泌的结构域igg1fc，因此显著地增强了e2蛋白的免疫原性，增加了施用对象体内产生的针对bvdv的中和抗体。

2、本发明的一个方面提供一种bvdv抗原片段，其特征在于，包含bvdv e2蛋白靠近n端的2个免疫球蛋白样（ig-like）结构域，即bvdv e2蛋白结构域i-ii，图4中给出了bvdv e2结构域i-ii空间结构位置示意图，所参考的bvdv e2蛋白结构（pdb: 4ild），其中所述2个免疫球蛋白样（ig-like）结构域对应图4中的dom.i和dom.ii。免疫球蛋白样结构域具备自稳定特征，其形成的空间结构不受上下游序列的影响；所述免疫球蛋白样结构域内部包含greek key拓扑构象的β-sheet结构。

3、进一步地，所述的bvdv抗原片段，其特征在于，包含bvdv1a e2蛋白结构域i-ii，bvdv1b e2蛋白结构域i-ii，和/或bvdv2 e2蛋白结构域i-ii中的一种或多种。

4、本发明的一个方面提供一种bvdv抗原融合片段，其特征在于，包含igg1 fc片段与bvdv1a e2蛋白结构域i-ii、bvdv1b e2蛋白结构域i-ii和/或bvdv2 e2蛋白结构域i-ii中的一种或多种融合。

5、进一步地，所述的抗原融合片段，其特征在于，所述igg1 fc片段为牛igg1 fc片段。

6、本发明的一个方面提供一种三价bvdv抗原融合片段，其特征在于，包含igg1 fc片段，bvdv1a e2蛋白结构域i-ii，bvdv1b e2蛋白结构域i-ii，和bvdv2 e2蛋白结构域i-ii。

7、进一步地，所述的三价bvdv抗原融合片段，其特征在于，所述三价bvdv抗原融合片段从n端到c端，依次包含牛igg1 fc片段，bvdv1a e2蛋白结构域i-ii，bvdv1b e2蛋白结构域i-ii，和bvdv2 e2蛋白结构域i-ii。

8、进一步地，所述的三价bvdv抗原融合片段，其特征在于，所述三价bvdv抗原融合片段还包含分泌信号肽。

9、本发明的一个方面提供一种bvdv抗原融合蛋白，其特征在于，包含如下任一序列：

10、（i）如seq id no.1所示的氨基酸序列；

11、（ii）如seq id no.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基获得的氨基酸序列，且与（i）所示的氨基酸序列具有相同的功能；或者，

12、（iii）与（i）或（ii）所述序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列，且与（i）所示的氨基酸序列具有相同的功能。

13、本发明的一个方面提供一种重组核酸，其特征在于，包含编码所述bvdv抗原片段、或所述bvdv抗原融合片段、或所述三价bvdv抗原融合片段、或所述bvdv抗原融合蛋白的核酸。

14、进一步地，所述的重组核酸，其特征在于，包含如下任一序列：

15、（i）如seq id no.2所示的核酸序列；

16、（ii）如seq id no.2所示的核酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核酸序列，且与（i）所示的核酸序列具有相同的功能；或者，

17、（iii）与（i）或（ii）所述序列具有至少90%序列一致性的核酸序列，且与（i）所示的核酸序列具有相同的功能。

18、本发明的一个方面提供一种重组mrna，其特征在于，包含编码所述bvdv抗原片段、或所述bvdv抗原融合片段、或所述三价bvdv抗原融合片段、或所述bvdv抗原融合蛋白的mrna。

19、进一步地，所述的重组mrna，其特征在于，所述mrna还包含5`-utr，3`-utr，polya序列，ires序列中的一种或多种。

20、进一步地，所述的重组mrna，其特征在于，所述5`-utr的序列如seq id no.3所示，所述3`-utr的序列如seq id no.4所示，所述polya的序列如seq id no.5所示，所述ires序列如seq id no.8所示。

21、本发明的一个方面提供一种表达盒，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna。

22、本发明的一个方面提供一种载体，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒；优选地，所述载体包含自复制载体；更优选地，所述自复制载体包含vee自复制载体；最优选地，所述载体的序列包含seq id no.7、seq id no.9、或seq idno.11所示的序列。

23、本发明的一个方面提供一种细胞，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体。

24、本发明的一个方面提供一种重组菌，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体；优选地，所述菌为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌为 e. coli bl21(de3)、 e. coli origami b(de3)或 e. coli rosetta blue(de3)中的一种；最优选地，所述大肠杆菌为 e. coli bl21(de3)。

25、本发明的一个方面提供一种组合物，其特征在于，包含所述bvdv抗原片段、或所述bvdv抗原融合片段、或所述三价bvdv抗原融合片段、或所述bvdv抗原融合蛋白、或所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体、或所述细胞、或重组菌。

26、本发明的一个方面提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述bvdv抗原片段、或所述bvdv抗原融合片段、或所述三价bvdv抗原融合片段、或所述bvdv抗原融合蛋白、或所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体、或所述细胞、或所述重组菌、或所述组合物。

27、本发明的一个方面提供一种三价bvdv mrna疫苗，包含：

28、(a) 所述重组mrna；和

29、(b) 药学上可接受的载体；优选地，所述载体包含脂类；更优选地，所述脂类包括阳离子脂质、可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、dmg-peg2000中的一种或多种。

30、本发明的一个方面提供一种表达重组三价bvdv mrna的加帽mrna重组表达载体、非加帽mrna重组表达载体或自复制rna重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

31、步骤a：合成所述重组核酸的基因片段；

32、步骤b：构建加帽mrna架构载体、构建非加帽mrna架构载体、或构建vee自复制载体；

33、所述加帽mrna架构载体包含5`-utr，3`-utr和polya序列以及固定加帽mrna架构的载体，序列分别如seq id no.3-6所示；或者，

34、所述非加帽mrna架构载体包含ires序列，3`-utr和polya序列，以及固定非加帽mrna架构的载体，其中ires的序列如seq id no.8所示；或者，

35、构建vee自复制载体：根据α病毒家族的基因组获得自复制rna序列；所述自复制rna序列包含编码α病毒自复制组件的基因，缺乏制造具有传染性的α病毒颗粒的结构蛋白的基因；将自复制rna序列构建获得的质粒作为模版扩增，通过合成获得所述vee自复制载体；所述vee自复制载体的序列如seq id no.10所示；

36、步骤c：制备加帽mrna、非加帽mrna或自复制rna重组表达载体；

37、将步骤a合成的基因插入加帽mrna架构载体中，得到加帽mrna重组表达载体，优选地，所述加帽mrna重组表达载体的序列如seq id no.7所示；或者，

38、将步骤a合成的基因插入非加帽mrna架构载体中，得到非加帽mrna重组表达载体，优选地，所述非加帽mrna重组表达载体的序列如seq id no.9所示；或者，

39、将步骤a合成的基因插入到vee自复制载体的指定位置，得到自复制rna重组表达载体, 优选地，所述自复制rna重组表达载体的序列如seq id no.11所示。

40、本发明的一个方面提供一种三价bvdv mrna疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

41、(a)提供所述重组mrna；

42、(b)将所述mrna与脂质颗粒进行混合并孵育，从而形成包裹有mrna的脂质纳米颗粒。

43、本发明的一个方面提供一种三价bvdv加帽mrna架构载体疫苗、非加帽mrna架构载体疫苗、或基于自复制rna结构载体疫苗的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

44、步骤a：将所述加帽mrna重组表达载体、非加帽mrna重组表达载体或自复制rna重组表达载体用限制性内切酶酶切线性化；

45、步骤b：将线性化的所述加帽mrna重组表达载体进行体外共转录加帽反应，将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mrna的5`端，并对模板dna进行降解；或者，

46、将线性化的所述非加帽mrna重组表达载体进行体外非加帽的转录反应，并对模板dna进行降解；或者，

47、将线性化的所述自复制rna重组表达载体进行体外共转录加帽反应，将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的rna的5`端，并对模板dna进行降解；

48、步骤c：将步骤b中各自制备的加帽、非加帽、自复制mrna分别与脂类混合，mrna包裹进入lnp内，得到mrna-lnp复合物，通过浓缩及换液制得制剂溶液，从而获得所述疫苗。

49、本发明的一个方面提供所述bvdv抗原片段、或所述bvdv抗原融合片段、或所述三价bvdv抗原融合片段、或所述bvdv抗原融合蛋白、或所述重组mrna在以下任一项中的用途：（i）制备治疗或预防bvdv感染引起的疾病的药物；或者，（ii）制备治疗或预防牛病毒性腹泻的药物；或者（iii）制备在施用对象体内诱导产生针对bvdv的特异性免疫反应的药物。

50、本发明的广谱抗牛科病毒性腹泻病毒的mrna疫苗具有如下有益技术效果：

51、1. 本发明通过使用一条mrna能够同时表达不同基因型bvdv的抗原，具有强免疫原性，在动物体内有效且高水平的分泌，从而诱导产生更高水平的针对bvdv1a、bvdv1b和bvdv2的特异性中和抗体，能够针对bvdv1a、1b和2等bvdv基因型毒株实现理想的免疫效果。由此，本发明三价bvdv mrna疫苗可有效阻断多种bvdv毒株所造成的交叉感染，降低对养殖业所造成的损失。

52、2. 本发明的抗原融合蛋白融合了助溶助分泌的结构域igg1 fc，因此显著地增强了e2蛋白的免疫原性，增加了体内产生的针对bvdv的中和抗体。因此可以用较少的疫苗剂量达到保护效果。因此减少接种剂量相应的也减少了脂质体使用量，进而减少脂质体所产生的细胞毒性，在保证免疫效果的同时降低了疫苗的毒性。

53、3. 本发明基于mrna的疫苗在小鼠实验中有很强的免疫反应，且mrna自身具有佐剂效应，因此能够诱导产生显著的免疫应答。

54、4. 本发明涉及三价bvdv mrna疫苗，其是利用线性化的质粒dna为模板，在体外进行酶转录反应合成的，该合成策略避免了活细胞培养生产方式，不需要考虑的安全性以及复杂的生产工艺等问题。

55、5. 本发明的三价bvdv mrna疫苗涉及mrna通用性疫苗平台，可以根据毒株的年度或季节性变异选择新的抗原序列，在不改变工艺流程的情况下快速开发新的疫苗。