一种通过原生质体自融合提高胶红酵母类胡萝卜素产量的方法

本发明属于生物工程领域，涉及一种通过原生质体自融合提高胶红酵母类胡萝卜素产量的方法。

背景技术：

1、胶红酵母(rhodotorula mucilaginosa)是隐球酵母科、红酵母属真菌，细胞呈圆形或卵形，无性繁殖为多边芽殖，无假菌丝；菌落呈红色或橘红色。其分布广泛，利用的营养素范围较广，是一种极具开发价值的酵母菌。类胡萝卜素是主要由40个碳原子组成的脂溶性萜类色素，含有多个共轭双键，具备较强的抗氧化能力。类胡萝卜素是维生素a前体，可对活性氧，包括单态氧、羟基自由基(·oh)和超氧化物(·o2-)有清除作用，能预防衰老、癌症、白内障和心血管以及神经退行性疾病等慢性退行性疾病，被广泛应用于食品、饲料、化妆品和医药行业中。动物自身不能合成类胡萝卜素，必须从食物中获取。胶红酵母可以天然合成类胡萝卜素，成分主要为β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、圆酵母素和红酵母红素。与从植物和蔬菜中提取类胡萝卜素相比，微生物发酵法合成类胡萝卜素具有生产周期短、对环境友好、不受季节影响、操作简便等优点，更适合工业应用。

2、原生质体融合(protoplast fusion)是一种用于转移包括遗传物质在内的胞质细胞器的非特异性重组技术，这个过程包括细胞壁破裂、原生质体再生、化学融合和电融合。原生质体融合也是一种有效的菌株改良方法，被广泛应用于发酵工业、基因工程和分子生物学。利用灭活原生质体筛选融合子是一种常用的融合子选择方法。热灭活的原理是使原生质体的核糖体或核糖体rna受到损伤，紫外线灭活的原理是使原生质体的dna造成损伤。由于这两种灭活方式对细胞致死性损伤的机制不同，根据致死性损伤的机制，这两种方法灭活的原生质体可以通过融合和互补再生。

3、原生质体融合常用于两个亲本的种内、种间融合，而本发明以胶红酵母中类胡萝卜素的合成为例，通过来源于同一亲本的胶红酵母原生质体自体融合技术，得到菌株多倍体，多倍体融合子的生长速度与类胡萝卜素含量均比亲株高，为提高微生物类胡萝卜素的生产提供了一种简便有效的方法。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种通过原生质体自体融合技术提高胶红酵母类胡萝卜素产量的方法，以胶红酵母(cicc 1725)作为出发菌株，并制备成原生质体，原生质体平均分成两份并分别进行热灭活和紫外灭活，灭活后的两份原生质体可以相互发生融合，获得的融合子通过摇瓶发酵筛选得到高产类胡萝卜素菌株。

2、本发明采用的具体技术方案是：

3、本发明提供一种通过原生质体自融合提高胶红酵母类胡萝卜素产量的方法，所述方法为：

4、(1)将胶红酵母1725的原生质体用kcl高渗缓冲液悬浮分散，得到原生质体悬浮液；取所述原生质体悬浮液分别进行紫外照射和60℃下热灭活，分别得到经紫外照射的原生质体和经热灭活的原生质体；

5、(2)将步骤(1)所述的经紫外照射的原生质体和经热灭活的原生质体混合，离心，所得菌体用pb缓冲液洗涤后，悬浮于助融剂中，30℃下静置10-50min，离心，所得菌体沉淀用kcl高渗缓冲液悬浮分散，涂布至kcl高渗固体培养基进行培养，得到单克隆；

6、(3)挑取步骤(2)所述的单克隆进行发酵培养，检测菌体胞内类胡萝卜素含量，筛选出高产类胡萝卜素的胶红酵母融合子。

7、在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述胶红酵母1725的原生质体按如下方法得到：胶红酵母1725经培养，所得菌体以pb缓冲液洗涤后，均匀悬浮于预处理液中30℃水浴处理30min，离心，所得菌体沉淀重悬于质量浓度为1％～4％的蜗牛酶溶液中酶解30～120min(优选于质量浓度为4％的蜗牛酶溶液中酶解120min)，离心，所得沉淀以kcl高渗缓冲液洗涤(2-3次)，得到胶红酵母1725的原生质体。进一步，所述培养的条件为：于ypd液体培养基中30℃，180rpm培养15h。更进一步，所述ypd液体培养基由以下终浓度的各组分组成：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，溶剂为水，ph自然。所述pb缓冲液由以下终浓度的各组分组成:磷酸氢二钠8.8g/l，磷酸二氢钠27.4g/l，溶剂为水，ph自然。

8、进一步，步骤(1)或(2)中所述kcl高渗缓冲液都由以下终浓度的各组分组成：40g/l kcl，磷酸氢二钠8.8g/l，磷酸二氢钠27.4g/l，溶剂为水，ph自然。

9、进一步，步骤(1)中所述紫外照射的条件为：15w紫外灯，照射距离为35cm，照射50～300s。优选地，紫外照射过程中，菌液处于搅拌下。

10、具体地，步骤(1)中所述经紫外照射的原生质体按如下方法得到：将所述原生质体悬浮液加水稀释20倍后，于50r/min搅拌下，15w紫外灯，照射距离为35cm，照射50～300s，黑暗中静置20min-1h，得到所述经紫外照射的原生质体。

11、进一步，步骤(1)中所述热灭活的条件为：60℃水浴下热灭活40～70min。

12、在本发明的一个实施例中，步骤(2)中经紫外照射的原生质体和经热灭活的原生质体以1：1的质量比混合。

13、进一步，步骤(2)中所述助融剂由以下终浓度的各组分组成：35wt％peg-6000，0.01mol/l cacl2，0.54mol/l kcl,溶剂为水，ph自然。

14、在本发明的一个实施例中，步骤(2)中所述培养的条件为：30℃培养2～3d。

15、进一步，步骤(2)中所述kcl高渗培养基由以下终浓度的各组分组成：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉20g/l，氯化钾40g/l，溶剂为水，ph自然。

16、在本发明的一个实施例中，步骤(3)所述发酵培养的过程为：挑取步骤(2)所述的单克隆接种于ypd液体培养基中30℃、180rmp培养20h，所得种子液以1％的体积接种量接种至gmy发酵培养基中，30℃，180rmp发酵72h。

17、所述ypd液体培养基由以下终浓度的各组分组成：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，溶剂为水，ph自然。

18、所述gmy发酵培养基由以下终浓度的各组分组成：酵母粉1.181g/l，葡萄糖50g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水硫酸镁1.5g/l，氯化钙50mg/l，七水硫酸锌20mg/l，溶剂为水，ph自然。

19、制备胶红酵母(cicc 1725)的原生质体，一部分原生质体经热灭活，另一部分原生质体经紫外灭活后，通过原生质体融合技术筛选获得高产类胡萝卜素融合子菌株，与出发菌株相比，该菌株类胡萝卜素含量明显提高。

20、本技术方案中，制备的胶红酵母融合子为胶红酵母(cicc 1725)原生质体自体融合所得，融合子单菌落通过摇瓶发酵筛选获得高产类胡萝卜素菌株。

21、所述原生质体中的一部分经热灭活至原生质体致死率达到89％～100％，另一部分经紫外灭活至原生质体致死率达到67％～100％。

22、进一步的，所述原生质体的制备条件是：蜗牛酶浓度为1％～4％，酶解时间30～120min。

23、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

24、(1)本发明主要针对一种菌株发生自体融合，其融合频率达15.8×10-5。

25、(2)对出发菌株原生质体一部分进行热灭活，另一部分进行紫外灭活后，利用原生质体融合技术进行自体融合，所获得高产类胡萝卜素菌株，正突变率达99％，代谢产物类胡萝卜素产量比出发菌株提高32.9％。