一种核酸释放剂及释放核酸方法及其应用与流程

本技术涉及分子生物学，尤其是涉及一种核酸释放剂及释放核酸方法及其应用。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction pcr)是如今使用最为广泛的核酸扩增技术，可以大量扩增所需的目的基因片段，从而实现检测微量核酸的目的。以其高灵敏度，高特异性从而得到广泛的应用。也衍生出了环介导等温扩增、滚环扩增等技术，但无论何种扩增方式，都需要将待测样本的核酸提取出来才可用于后续的pcr扩增中。

2、由于常规的核酸提取方法如碱裂解法、萃取法、柱提法、磁珠法等都存在耗时过长、应用场景不够宽泛、操作复杂等问题，因此核酸释放剂的出现意义重大，核酸释放剂可用于各类样本的的快速裂解，且裂解后的核酸产物可直接用于后续的pcr扩增反应中。

3、目前已有核酸释放剂在核酸检测领域使用，但是大部分核酸释放剂仍然需要对样本进行灭活处理，或者需要对样本和核酸释放剂加热孵育一段时间。因此，发明人认为现有的核酸释放剂仍然存在需时较长、操作步骤较多等问题，亟需研发一种操作步骤简单、耗时较少、能够提高整个样本检测流程速度的核酸释放剂。

技术实现思路

1、为了解决现有的核酸释放剂需时较长、操作步骤较多的问题，本技术提供一种新的核酸释放剂，该核酸释放剂使用时无需对检测样本进行灭活处理，也无需加热孵育，操作简单，耗时更短，能够提高整个样本检测流程的速度。将其应用于不同样本的核酸检测中，能够省时省力，提高核酸检测效率。

2、第一方面，本技术提供一种核酸释放剂，采用如下技术方案：

3、所述核酸释放剂包括以下成分：0.01-2wt％的tritonx-100、0.01-0.5wt％的sds、10-150mm的异硫氰酸胍、0.2-1wt％的还原剂、0.1-5wt％的氯化钠、50-300mm的tris-hcl、10-200mm的edta和0.01-4wt％的消泡剂。

4、通过采用上述技术方案，tritonx-100能够溶解细胞膜中的脂质，增加细胞膜的通透性；sds是蛋白变性剂，能够裂解细胞，将核蛋白变性，破坏其二级结构从而使其与核酸分离；异硫氰酸胍是一种强力蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎；还原剂能够促使sds和异硫氰酸胍产生协同作用，破坏蛋白质的疏水作用，缩短细胞的裂解时间，使核酸能够更快地释放出来，溶解在tris-hcl溶液中；适量氯化钠的添加能够提高pcr反应体系的活性，使其能够有效地催化酶-dna复合物的形成；edta作为一种金属离子螯合剂，能够与核酸酶作用所需的mg2+相结合，从而抑制核酸酶的活性，保证核酸的浓度；由于sds溶液在配制过程中极其产生泡沫，消泡剂能够加快泡沫消失的速度，便于配置溶液，从而缩短溶液配制的时间。

5、在一些具体的实施例中，所述消泡剂选自乳化硅油、聚氧丙烯甘油醚和聚二甲基硅氧烷中的一种或多种。本技术中所采用的聚氧丙烯甘油醚的分子量为3000-3300，聚二甲基硅氧烷的分子量为30000-65000。

6、本技术所述核酸释放剂中tris-hcl以tris-hcl缓冲液的形式添加，tris-hcl缓冲液的ph值为7.0-8.0。

7、作为优选：所述核酸释放剂包括以下成分：0.5-1.2wt％的tritonx-100、0.2-0.4wt％的sds、30-80mm的异硫氰酸胍、0.5-0.8wt％的还原剂、1-3wt％的氯化钠、150-300mm的tris-hcl、10-200mm的edta和1-2wt％的消泡剂。

8、通过采用上述技术方案，经多次核酸检测实验发现，由上述成分及其用量配制成的核酸释放剂的效果更好。

9、作为优选：所述核酸释放剂的ph值为7.0-9.5。

10、通过采用上述技术方案，发明人经过多次实验研究发现，配制的核酸释放剂ph值处于7.0-9.5时，所提取的溶液中核酸浓度更高，核酸释放效果更好。

11、作为优选：所述还原剂包括β-巯基乙醇和dtt。

12、通过采用上述技术方案，将β-巯基乙醇和dtt同时加入核酸释放剂中，二者共同作用，使得还原剂促进sds和异硫氰酸胍共同破坏蛋白质疏水作用的效果最佳，进一步缩短细胞裂解的时间。

13、作为优选：所述β-巯基乙醇和dtt的质量比为(0.5-2):(0.3-1)。

14、在一些优选的实施方式中，β-巯基乙醇和dtt的质量比可以为1:0.5或1.8:0.7等。

15、第二方面，本技术提供一种上述核酸释放剂释放核酸的方法，采用如下技术方案：

16、所述释放核酸的方法包括如下步骤：

17、s1、将待测样本与所述核酸释放剂混合，得到混合的样本；

18、s2、振荡所述混合的样本后离心，上清液放置待用。

19、通过采用上述技术方案，将待测样本与核酸释放剂混合并振荡，使待测样本中的细胞与核酸释放剂充分接触反应，细胞裂解后，核酸游离并溶于核酸释放剂中，通过离心使细胞碎片和核酸释放剂中的杂质与核酸分离，核酸溶于上清液中，便于后续检测步骤的进行。

20、在一些具体的实施例中，步骤s2中，可以对混合的样本进行手动振荡或使用振荡器振荡。

21、作为优选：所述待测样本与所述核酸释放剂的混合体积比为1:(1-10)。

22、通过采用上述技术方案，待测样本的种类不同，待测样本与核酸释放剂的混合体积比随之调整，减小因核酸释放剂添加量少导致核酸无法充分释放的可能性。

23、在一些具体的实施例中，咽拭子样本与核酸释放剂的混合比例为1:1；全血样本与核酸释放剂的混合比例为1:9，新冠假病毒样本与核酸释放剂的混合比例为1:1，痰液样本与核酸释放剂的混合比例为1:1。

24、作为优选：所述振荡时间为0.5-2min。

25、通过采用上述技术方案，由于核酸释放剂的裂解效率较高，短时间的振荡使细胞与核酸释放剂充分接触即可，振荡时间无需过长，缩短整个样本检测流程的需时。

26、在一些具体的实施例中，震荡时间为60-90s。

27、作为优选：所述离心速度为8000-15000rpm/min，所述离心时间为10-30s。

28、通过采用上述技术方案，使用上述离心条件将细胞碎片和核酸释放剂中的杂质与核酸分离即可，尽可能在不影响核酸检测的前提下缩短离心时间，从而缩短整个样本检测流程的需时。

29、在一些优选的实施方式中，离心速度为13000rpm/min，离心时间为10-20s。

30、第三方面，本技术提供一种如上所述的核酸释放剂，或上述核酸释放的方法在拭子类样本、全血样本、假病毒和痰液样本的核酸检测中的应用。

31、本技术中所述拭子类样本例如可以为肛拭子样本、咽拭子样本和鼻拭子样本等。

32、本技术所述的核酸释放剂或者核酸释放的方法具有检测需时更短、操作步骤更加简单便捷的优点，将其应用于拭子类样本、全血样本、假病毒和痰液样本的核酸检测中，能够大大缩短核酸检测的耗时，提高样本核酸检测的效率，具有良好的市场前景。

33、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

34、1、tritonx-100、sds和异硫氰酸胍共同作用使细胞裂解，将核酸释放出来。另外，核酸释放剂中的还原剂能够促使sds和异硫氰酸胍产生协同作用，破坏蛋白质的疏水作用，缩短细胞的裂解时间，使核酸能够更快地释放出来，缩短了样本核酸检测的需时，且整个流程操作简单。

35、2、本技术中同时使用β-巯基乙醇和dtt作为还原剂，二者共同作用，使得还原剂促进sds和异硫氰酸胍共同破坏蛋白质疏水作用的效果最佳，进一步缩短了细胞裂解的时间。