水稻育性基因OsRIP1以及应用

本发明涉及生物，具体涉及水稻育性基因osrip1以及应用。

背景技术：

1、水稻育性是影响水稻产量的关键因素，在开花植物中，雄配子生殖发育是重要的生物学过程，也是高等植物普遍经历的生长过程。植物雄性不育指在有性繁殖过程中，由于生理上或遗传上的原因造成雄蕊不能产生有正常功能的雄配子体(如花药中无花粉、花粉败育和花药不开裂等)，然而雌蕊却发育正常，能够接受外来成熟花粉而正常受精结实的遗传现象。

2、雄性不育是开花植物中普遍存在的一种现象，它为植物杂种优势的利用打开了大门，具有重要的生产应用价值。自花授粉植物杂种优势最成功的应用是水稻不育系的发现和杂交水稻的大面积应用。植物雄性不育是指花药、花粉或雄配子体发育异常而导致的败育现象，主要表现为缺乏正常的花药、花粉或雄配子，但雌蕊发育正常，可以接受外来花粉而受精结实。植物雄性不育为研究花粉发育、细胞质遗传和核质互作提供了重要材料，也成为开展农作物杂种优势、轮回选择和群体改良的重要工具。

3、目前植物中克隆的核不育相关基因基本上都是隐性的，显性核不育基因的克隆鲜有报道，究其原因可能是自然界突变多为隐性突变而显性突变很少。到目前为止，仅在10余种作物上发现了24例显性核不育材料，因此显性核不育材料是一种非常罕见且宝贵的育种以及研究材料。太谷显性核不育小麦是我国宝贵的小麦遗传资源，在小麦育种和种质创新等方面有着重要用途。刘秉华等人在太谷核不育的基础上创立了利用矮败小麦开展“以轮回选择为主、多种途径综合运用”的小麦高效育种体系。该育种体系包括基础群体的构建、亲本的选择与控制、优良基因的引入和不良植株的淘汰、改良群体的组建和优良品种的选育等过程。

4、osrip1编码一个核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein，rip)。rip广泛分布于单子叶植物中，能够结合在哺乳动物的核糖体上，通过脱嘌呤作用破坏rrna的s/rloop使得核糖体失去翻译功能。关于rip的生化功能已经被广泛报道，但是rip在植物中的生理功能依然不清楚，目前为止没有关于rip影响植物育性的报道。在水稻花药中特异性表达osrip1时能够创制显性核不育水稻。

技术实现思路

1、本发明提供了显性核不育相关基因osrip1，水稻显性核不育基因的发现与应用为植物杂种优势的利用打开了大门，具有重要的生产应用价值，显性核不育材料可以更加有效的，简便的进行轮回选择以及群体改良，也可以用于聚合多个关键的优质基因。在未来能够利用本发明的基因，通过创制显性核不育材料能够大大提高水稻育种效率，将有利于创制优异种源，提高杂交效率，来培育高产、抗逆性强和适应性广的优质水稻品种，因而在植物育种上具有重要的利用价值。

2、本发明目的之一在于提供一种核糖体失活蛋白osrip1。

3、本发明目的之二在于提供一种显性核不育基因osrip1。

4、本发明目的之三在于提供创制显性核不育材料关键基因osrip1的应用。

5、其中，所述相关生物材料可为能够表达所述osrip1蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

6、所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达osrip1的dna，该dna不但可包括启动osrip1基因转录的启动子，还可包括终止osrip1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap"，chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene，56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet，262:141；proudfoot(1991)cell，64:671；sanfacon等人genes dev.，5:141；mogen等人(1990)plantcell，2:1261；munroe等人(1990)gene，91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.，15:9627)。

7、构建含有所述osrip1基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或gateway系统载体等，如pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pgwb411、pgwb412、pgwb405、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用osrip1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

8、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

9、上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

10、上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)(如根癌农杆菌eha105)，黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽胞杆菌属(bacillus)等。

11、所述核糖体失活蛋白osrip1可为如下任一：

12、(a1)氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质；

13、(a2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

14、(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

15、(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

16、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

17、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

18、上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

19、在所述植物中，所述osrip1蛋白的表达量和/或活性增加，所述植物由正常的自交可育变为显性核不育。

20、本发明的目的通过下列技术方案实现：

21、本发明提供一种水稻显性核不育蛋白osrip1，其是核糖体失活蛋白。在水稻显性核不育材料dms1中，osrip1在水稻花粉母细胞时期高表达，直接抑制了核糖体的翻译功能，使得花药无法合成蛋白质从而死亡。osrip1的蛋白大小32.5kd，含有一个保守的核糖体失活蛋白结构域，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

22、本发明还提供一种水稻雄性减数分裂胞质分离关键基因osrip1，其dna序列如seqid no.2所示。osrip1的cds全长为855bp，包含3个外显子，2个内含子。dms1是osrip1基因的启动子插入了1978bp的dna片段导致显性核不育。

23、本发明还提供对osrip1基因及其编码的蛋白参与调控显性核不育表型的机制，尤其是核糖体失活蛋白抑制翻译的作用机制的探索。

24、本发明还提供所述蛋白osrip1或基因osrip1或水稻显性核不育材料dms1在水稻育种工作中的应用。

25、本发明还提供所述蛋白osrip1或基因osrip1或水稻显性核不育材料dms1在水稻育种研究中的应用。具体的为，将正常野生型水稻在花药中表达osrip1能够得到显性核不育水稻。

26、本发明还提供所述的基因osrip1或所述的蛋白osrip1在改善雄性不育水稻中的应用，所述应用具体为将基因osrip1在显性核不育水稻中敲除，能够恢复其育性。雄性不育水稻通常为基因osrip1在花药中表达导致的不育。

27、本发明还提供所述蛋白osrip1或基因osrip1在水稻育种中的应用。一些实施例中，将正常野生型水稻在花药中表达osrip1；在另一些实施例中，将基因osrip1在显性核不育水稻中敲除，能够恢复其育性。

28、本发明还提供所述蛋白osrip1或基因osrip1在制药和化学工业中的价值。

29、通过对本发明所述显性核不育材料dms1的研究，本发明获得了显性核不育相关基因osrip1。水稻显性核不育基因的发现与应用加深了对细水稻育性的认知，雄性不育是开花植物中普遍存在的一种现象，它为植物杂种优势的利用打开了大门，具有重要的生产应用价值。显性核不育材料可以更加有效的，简便的进行轮回选择以及群体改良，也可以用于聚合多个关键的优质基因。在未来能够利用本发明的基因，通过创制显性核不育材料能够大大提高水稻育种效率，将有利于创制优异种源，提高杂交效率，来培育高产、抗逆性强和适应性广的优质水稻品种，因而在植物育种上具有重要的利用价值。

30、本发明发现的osrip1基因的突变会导致显性雄性核不育，败育的雄配子致使水稻不能正常受精结实，严重影响植株产量，因此研究这一类基因导致水稻不育的分子机制，将为未来基因改造和育种应用方面提供有利帮助。