具有免疫刺激活性的CpG寡聚核苷酸及其用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及多种cpg寡聚核苷酸及其用途。

背景技术：

1、先天免疫系统是人体或哺乳动物检测和抵抗病毒、细菌、寄生虫、毒素等入侵或感知创伤的第一道防线。人体的先天免疫系统由体表屏障、鼻黏膜的纤毛粘液及表达众多toll样受体的免疫细胞组成。目前人体中发现的toll样受体有11个，微生物进入人体后，可触发单个或数个toll样受体而激发先天免疫系统，进而产生大量的i型干扰素及激活nk细胞等先天免疫细胞，达到清除病原微生物的目的。

2、tlr-9为最重要的toll样受体之一，其配体是去甲基化的病毒或细菌的含有cpg的dna片段。病毒或细菌的cpg片段进入细胞的内体，和tlr-9结合后激活的一系列信号传递会产生大量的i型干扰素、募集nk细胞、树突样细胞及其他相关的免疫反应。

3、cpg寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxyribonucleotides，odn)可直接激活浆细胞样树突状细胞、b细胞等细胞。由此产生的免疫反应的特征在于产生th1细胞因子和促炎细胞因子以及多反应性免疫球蛋白。这种先天免疫反应为抗原特异性适应性免疫奠定了基础。因此免疫刺激寡核苷酸可用于治疗、预防或改善免疫系统缺陷(例如，肿瘤或癌症或病毒、真菌、细菌或寄生虫感染)引起的疾病。

4、通过改善抗原呈递细胞的功能，cpg odn有助于体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。临床前研究表明，当全身或粘膜给药时，cpg odn可显著提高免疫反应，从而提高传染病疫苗、癌症疫苗的活性。临床试验表明，cpg odn具有良好的安全性，并增加了共用疫苗的免疫原性。

5、从2019年的原始毒株开始，sars-cov-2经历了alpha,beta,delta和omicron毒株的演变，传染性越来越强，传染率从最初alpha的ro为2到omicron的ro为10。现有研究表明，sars-cov-2越来越强的传染力和它基因组里越来越少的cpg含量有关。人体中锌指抗病毒蛋白(zinc finger antiviral protein，zap)是先天免疫的一个重要机制：它可识别并特异性结合病毒的cpg二核苷酸并招募其他蛋白质来降解病毒rna基因组。而sars-cov-2通过一系列突变，减少了基因组中cpg的数量，使其能逃逸机体先天免疫系统的识别和降解。此外，sars-cov-2也产生一些物质抑制i型干扰素的激活，使其逃逸先天免疫系统的攻击。因此当人体暴露在存在sars-cov-2感染风险的环境中时，通过体外补充含有cpg的odn，将有希望恢复人体对sars-cov-2的免疫反应，进而减少感染风险。

6、很多病毒或其他病原微生物感染人类时，往往从上呼吸道和鼻粘膜开始，在局部大量繁殖后下行到下呼吸道和肺部，引起肺炎。如sars-cov-2进入鼻腔黏膜后，和黏膜上皮的纤毛细胞表达的ace2受体结合然后进入细胞，利用宿主细胞大量繁殖病毒。当黏膜先天免疫力强时，强大的i型干扰素可直接杀灭和抑制病毒的繁殖，将病毒局限在上呼吸道并减少病毒颗粒，防止了病毒的下行和肺部感染(肺炎)的发生，同时减少了人群间的传播。当鼻黏膜免疫力低下时，病毒将快速繁殖并下行到肺部引起肺炎，同时产生大量病毒颗粒，引起人群间的传播。

7、如在sars-cov-2感染前或感染后初期从鼻腔黏膜喷入含cpg的寡聚核苷酸，可刺激鼻腔黏膜的免疫系统(nose associated lymphoid tissue,nalt)产生强大的先天免疫(i/ii/iii型干扰素的产生)和th1免疫反应(dc，nk和cd8t细胞的激活，il-12的产生)，将病毒抑制或杀灭，使感染局限于上呼吸道，无法下行到肺部引发肺炎。

8、现有临床前研究表明将cpg odn应用于呼吸道感染性疾病的预防和治疗是一个非常有效的策略。因此，亟需临床开发具备阻断呼吸道病毒感染和传播的新型cpg odn。

9、此外，目前cpg odn虽然在肿瘤治疗和传染性疾病预防中是一种强有力的th1型免疫刺激物，但其作为人或动物疫苗佐剂的应用仍很有限，仅有dynavax公司的cpg 1018获批用于乙肝疫苗的生产，更多安全、高效的cpg odn疫苗佐剂亟待研发。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明公开了多种具有免疫刺激活性的cpg寡聚核苷酸及其应用。本发明提供了多种不同类型的cpg odn。

2、在一个方面，本公开提供了cpg寡聚核苷酸，其包含选自seq id no:9-14、1-8和15-18的任一种的序列。

3、在一些实施方案中，所述cpg寡聚核苷酸的序列中还包含修饰，所述修饰选自例如但不限于，硫代修饰、甲氧基修饰和氟代修饰。在一些实施方案中，所述cpg寡聚核苷酸中的至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。

4、在一些实施方案中，所述cpg寡聚核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。

5、在一些实施方案中，所述cpg寡聚核苷酸为单链或双链。

6、在一个方面，本公开提供了一种缀合物，其包含前述权利要求中任一项所述的cpg寡聚核苷酸缀合于纳米粒子。所述纳米粒子选自但不限于，plga、壳聚糖、脂质体和脂质模块。

7、在一些实施方案中，所述cpg寡聚核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键缀合于纳米粒子。

8、在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文的cpg寡聚核苷酸或缀合物，以及药学上可接受的载剂。

9、在一个方面，本公开提供了本文的cpg寡聚核苷酸或缀合物用作佐剂的用途。

10、在一个方面，本公开提供了本文的cpg寡聚核苷酸与mf59或isa201组合用作佐剂的用途。所述佐剂可以是用于疫苗的佐剂。

11、在一个方面，本公开提供了本文的cpg寡聚核苷酸或缀合物在制备提高免疫细胞增殖功能或提高免疫细胞细胞因子释放功能的药物中的应用。

12、在一个方面，本公开提供了本文的cpg寡聚核苷酸或缀合物在制备预防或治疗病毒感染、细菌感染性疾病、真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病的药物中的应用。所述病毒感染可选自例如covid-19感染、流感病毒感染和呼吸道合胞病毒感染。

13、在一些实施方案中，所述细菌感染性疾病或真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病发生在呼吸道。

14、在一个方面，本公开提供了本文的cpg寡聚核苷酸或缀合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

15、在一个方面，本公开提供了本文的cpg寡聚核苷酸或缀合物在制备疫苗组合物中的应用。

16、在一些实施方案中，所述疫苗组合物为人用或动物用疫苗组合物，例如猪用疫苗组合物。所述疫苗组合物可以是预防或治疗病毒感染、细菌感染性疾病、真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病的疫苗组合物。

17、本发明还涉及以下实施方案：

18、1.含有未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的免疫刺激性寡聚核苷酸，大小在10到50个碱基之间，该寡聚核苷酸由未经修饰或经过修饰的核苷酸单体组成，修饰类型包括硫代修饰、甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰，纳米粒子修饰包括plga，壳聚糖和脂质体。

19、2.cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下八个c型cpg寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下八个中的任一个：5’-t-c-g-t-c-g-c-g-t-t-c-g-c-c-g-c-c-t-t-c-g-a-a-g-g-c-g-g-3’；

20、5’-t-c-g-t-c-g-c-g-a-a-c-g-c-c-g-c-g-t-a-c-g-t-a-c-g-c-g-g-3’；

21、5’-t-c-g-t-c-g-c-g-a-t-c-g-c-c-g-c-g-a-t-c-g-a-t-c-g-c-g-g-3’；

22、5’-t-c-g-c-g-a-c-g-t-t-c-g-t-c-g-c-c-g-g-t-t-c-g-a-a-c-c-g-g-3’；5’-t-c-g-c-g-a-c-g-t-t-c-g-t-c-g-t-c-g-c-g-g-c-g-c-g-c-g-c-c-g-

23、3’；

24、5’-t-c-g-t-c-g-t-t-t-g-t-c-g-t-t-g-t-c-g-c-g-g-c-g-c-g-c-g-c-c-g-3’；

25、5’-t-c-g-t-c-g-t-t-t-g-t-c-g-c-c-g-c-g-t-a-c-g-t-a-c-g-c-g-g-3’；

26、5’-t-c-g-t-c-g-t-t-t-g-t-c-g-c-c-g-c-g-t-t-c-g-a-a-c-g-c-g-g-3’。

27、3.根据实施方案2所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。

28、4.根据实施方案2所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。

29、5.根据实施方案2所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。

30、6.根据实施方案2所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括plga、壳聚糖、脂质体。

31、7.cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下六个b型cpg寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下六个中的任一个：

32、5’-t-c-g-a-c-g-t-t-c-g-t-c-g-t-t-c-g-t-c-g-t-c-g-t-3’；

33、5’-t-c-g-t-c-g-t-c-g-t-t-c-g-t-c-g-t-c-g-t-3’；

34、5’-t-c-g-c-c-c-g-t-c-g-c-c-a-g-c-g-a-g-g-c-g-t-t-t-3’；

35、5’-t-c-g-t-c-g-t-c-g-t-t-g-t-c-g-t-c-g-t-t-3’；

36、5’-t-c-g-a-c-g-t-c-g-t-c-g-a-c-g-t-t-c-g-t-3’；

37、5’-t-c-g-a-c-g-a-c-g-t-c-g-t-t-c-g-t-c-g-t-t-3’。

38、8.根据实施方案7所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。

39、9.根据实施方案7所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。

40、10.根据实施方案7所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。

41、11.根据实施方案7所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括plga、壳聚糖、脂质体。

42、12.cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下两个a型cpg寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下两个中的任一个：

43、5’-g-g-g-g-c-g-c-g-a-c-g-c-g-t-c-g-c-g-g-g-g-g-g-3’；

44、5’-g-g-g-g-g-c-g-a-c-g-c-g-t-c-g-c-g-g-g-g-g-3’。

45、13.根据实施方案12所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。

46、14.根据实施方案12所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。

47、15.根据实施方案12所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。

48、16.根据实施方案12所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括plga、壳聚糖、脂质体。

49、17.cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下两个p型cpg寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下两个中的任一个：

50、5’-t-c-g-t-c-g-a-c-g-a-t-t-c-g-g-c-g-c-g-c-g-c-c-g-3’；

51、5’-t-c-g-t-c-g-a-c-g-a-t-a-c-g-g-c-g-c-g-c-g-c-c-g-3’。

52、18.根据实施方案17所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。

53、19.根据实施方案17所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。

54、20.根据实施方案17所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。

55、21.根据实施方案17所述的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括plga、壳聚糖、脂质体。

56、22.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在提高机体免疫治疗药物中的应用。

57、23.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有提高免疫细胞增殖功能的药物中的应用。

58、24.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有提高免疫细胞细胞因子释放功能药物中的应用。

59、25.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗病毒对机体感染的药物中的应用。

60、26.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗covid-19感染的药物中的应用。

61、27.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗流感病毒感染的药物中的应用。

62、28.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗sars-cov感染的药物中的应用。

63、29.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗呼吸道细菌感染性疾病功能的药物中的应用。

64、30.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗呼吸道真菌感染性疾病功能的药物中的应用。

65、31.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗呼吸道寄生虫感染性疾病功能的药物中的应用。

66、32.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在治疗肿瘤药物中的独立应用。

67、33.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有治疗肿瘤药物中的联合应用。

68、34.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗肿瘤药物中作为佐剂的应用。

69、35.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在人用疫苗药物中的应用。

70、36.如实施方案1-21任意一项所述的cpg寡聚脱氧核苷酸在动物用疫苗药物中的应用。

71、37.如实施方案1-36任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为鼻喷给药、肺部吸入、口服、肛门给药、生殖道给药、皮下注射、肿瘤内注射或静脉注射。

72、本发明还提供了cpg odn在预防和治疗其他病毒对机体感染的药物中的应用。