一种从Cohn组分Ⅰ沉淀及人凝血因子Ⅷ层析弃液中提取人纤维蛋白原的方法与流程

本发明属于生物制药和血液制品，具体涉及血液制品生产中一种从cohn组分i沉淀及人凝血因子ⅷ层析弃液中提取高纯度人纤维蛋白原制剂的生产方法。

背景技术：

1、人纤维蛋白原即凝血因子i，是血浆中含量最高的凝血因子，也是人体凝血系统的重要成份之一，分子量约为340kd，在血浆中含量一般在2～4g/l。人纤维蛋白原是一种含2964个氨基酸的大分子糖蛋白，由肝细胞合成，半衰期为3～4.5天，25％的纤维蛋白原分布于血管外间隙和淋巴液中。纤维蛋白原在体内经凝血酶的作用转变成不溶性的纤维蛋白，再由单体变为聚合物，并在xiii因子参与下使其聚合更稳定而达到凝血和止血功能，并参与体内一系列病理、生理过程，如炎症、组织损伤、修复等，对治疗获得性或先天性纤维蛋白原缺乏或低下造成的凝血障碍有极其重要的作用。

2、在临床上严重创伤、烧伤、弥散性血管内凝血(dic)、败血症、急性呼吸窘迫症、肝衰竭时，均会导致体内纤维蛋白原缺乏，需要及时地补充，每天的输注量在4～6g，加上纤维蛋白原本身半衰期较短，需维持的周期也较长，我国每年临床需求量巨大，随着临床医生的逐步认可，人纤维蛋白原产品的使用量也在逐年增加。因此，该制品市场缺口巨大、市场前景广阔；属于国家食品药品监督管理局鼓励研究开发、优先审批的产品，符合国家产业政策和市场需求。目前，我国原料血浆紧张，血浆来源的高纯人纤维蛋白原产品处于临床供应严重不足的状态，其生产制备引起了各方面的关注。

3、目前，人纤维蛋白原制备的主要方法有blomback法、kabi法、biocol法、膜径向离子交换层析法等。blomback法为早期使用的工艺，其工艺流程如下：以新鲜血浆或新鲜冰冻血浆为原料，乙醇沉淀(8％乙醇、-3℃、ph7.0～7.2)，上清分离其他成分，组分i加1/4体积1.0mol/l甘氨酸、0.055mol/l柠檬酸三钠、6.6％乙醇，ph6.8、-2℃沉淀，上清弃去，沉淀重复以上步骤；沉淀溶于0.1mol/l氯化钠、0.025mol/l柠檬酸三钠、ph7.0、30℃，除菌过滤冻干。kabi法基本工艺流程同blomback法，以新鲜血浆或新鲜冰冻血浆为原料，乙醇沉淀(8％乙醇、-3℃、ph7.0～7.4、μ0.14)，上清分离其他成分，组分ⅰ经过含1.0mol/l甘氨酸、7％乙醇、ph6.0、-2℃的柠檬酸缓冲液两步萃取后，溶于ph6.2、27℃柠檬酸缓冲液中，经硫酸钡吸附去除杂蛋白后，上清除菌过滤冻干。biocol法是目前研究和使用最广泛的方法。工艺如下：全血浆于37℃融化，以预冷的10％乙醇作6小时以上沉淀处理，离心分离得到纤维蛋白原浓缩物。该浓缩物再溶于中性ph的tris/柠檬酸钠/赖氨酸缓冲液，并用有机溶剂/表面活性剂(s/d)作病毒灭活处理，然后在4℃再用预冷乙醇作10～12小时的第二次10％乙醇沉淀。产生的沉淀再溶于中性ph的tris/氯化钠缓冲液中，并用超滤浓缩法调节蛋白含量，除菌过滤、分装冻干制得成品。

4、现有常规生产工艺多以组分i沉淀为原料，采用两步乙醇沉淀法或两步甘氨酸沉淀法分离纯化出人纤维蛋白原制品，并经1～2步病毒灭活步骤降低制品中的病毒风险。然而由于单一沉淀剂可分离的蛋白种类有限，因此，采用两步乙醇沉淀法或两步甘氨酸沉淀法所制得的人纤维蛋白原制品纯度较低，仅为70％左右；同时，由于工艺流程中仅存在1～2步病毒灭活步骤(s/d或甘氨酸沉淀)，以上方法生产的人纤维蛋白原制品其病毒安全性较差，存在一定的病毒风险。

5、近年来出现的层析工艺已成功应用于纤维蛋白原的分离纯化：组分i沉淀溶入tris-hcl缓冲液，离心取上清。采用ph7.5，0.06mol/ltris-hcl缓冲液平衡后的层析柱进行层析，并以ph7.5，0.06mol/l tris-hcl，1.0mol/l氯化钠缓冲液洗脱出人纤维蛋白原。采用层析工艺生产的人纤维蛋白原制品纯度较高，但层析工艺耗时久，难以实现高效化、规模化生产；同时，由于人纤维蛋白原分子在冷沉淀和组分i沉淀中均有分布，仅以组分i沉淀为原料无形中对冷沉淀中的人纤维蛋白原成分造成了浪费，其工艺收率和原料综合利用率较低，对宝贵的血浆资源造成极大浪费。

6、综上所述，市场急需一种纯度更高、病毒安全性更好，同时工艺收率高，最大程度提高血浆综合利用率的高纯人纤维蛋白原制剂的制造方法，来最大限度的满足临床病人的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种纯度更高、病毒安全性更好，同时工艺收率高，最大程度提高血浆综合利用率的高纯人纤维蛋白原制剂生产方法。为实现此目的，本发明采用以下技术方案。

2、一种从cohn组分i沉淀及人凝血因子ⅷ层析弃液中提取高纯度人纤维蛋白原制剂的生产方法，其特征在于包含以下步骤：

3、1.组分i沉淀的制备：向去除冷沉淀后的血浆中加入-20℃以下的低温95％乙醇，使血浆中的乙醇终浓度为8～9％，调节ph值为6.8～7.0，于-4～0℃条件下恒温连续离心，制得组分i沉淀；

4、2.组分i沉淀溶解：用预升温至20～30℃的溶解缓冲液i溶解组分i沉淀，溶解缓冲液i用量为组分i沉淀重量的3～7倍，搅拌溶解1～2h；

5、3.人凝血因子ⅷ层析弃液的收集及合并；

6、(1)血浆冷沉淀的制备：取-20℃冷库贮存一年内的冷冻人血浆原料，经-5～-3℃预升温处理24～36h，并于0～4℃恒温融浆至完全融化；温和搅拌下对完全融化的血浆进行混合，形成均一血浆原料，并于0～4℃恒温静置4～8h；静置后血浆于0～4℃恒温连续离心，制得冷沉淀；

7、(2)冷沉淀溶解：用预冷至15～20℃的生理盐水溶解冷沉淀，并添加8～10iu/ml肝素作为保护剂，生理盐水用量为冷沉淀重量的7～9倍，搅拌溶解60min；

8、(3)铝胶吸附：将溶解液升温至25～28℃，加入3％氢氧化铝凝胶，加入量为冷沉淀重量的40％，添加完毕后降温至15～20℃，12000rpm离心，制得离心上清液；

9、(4)离子交换层析：离心上清液使用0.45um滤芯过滤后上样至预先平衡的离子交换层析柱，吸附完毕的层析柱经洗涤、洗脱后的洗脱液即可用于人凝血因子ⅷ的制备，未吸附至层析柱的人凝血因子ⅷ层析弃液(上样流穿液)并入组分i沉淀溶解液，共同搅拌1～3h制得共溶解液，作为人纤维蛋白原生产原料；

10、4.溶解液过滤：使用板框压滤机串联10英寸1um滤芯过滤上述共溶解液，收集澄清滤过液。

11、5.s/d灭活病毒：温和搅拌下将配置好的s/d灭活液缓慢加入过滤后的澄清滤过液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24～26℃，灭活6h；

12、6.甘氨酸沉淀：向灭活后料液中缓慢加入20％甘氨酸溶液，使料液中的甘氨酸终浓度为1～3mol/l，充分搅拌后降温至2～8℃，保温约1h，待蛋白充分沉淀后8000rpm连续离心，收集第一次沉淀；

13、7.一次沉淀溶解及过滤：用预升温至20～30℃的溶解缓冲液ii溶解第一次沉淀，溶解缓冲液ii用量为沉淀重量的5～10倍，搅拌溶解1～2h；使用板框压滤机串联10英寸1um滤芯过滤上述溶解液，收集澄清滤过液；

14、8.乙醇沉淀：向上述澄清滤过液中加入-20℃以下的低温95％乙醇，使滤过液中的乙醇终浓度为8～9％，调节ph值为6.8～7.5，于-4～0℃条件下恒温连续离心，收集第二次沉淀；

15、9.二次沉淀溶解及过滤：用预升温至20～30℃的溶解缓冲液iii溶解第二次沉淀，溶解缓冲液iii用量为沉淀重量的3～7倍，搅拌溶解1～2h；使用10英寸0.45um滤芯过滤上述溶解液，制得人纤维蛋白原原液；

16、10.配液：向人纤维蛋白原原液中加入保护剂，所述保护剂为盐、糖、氨基酸或其混合物；使用稀释液对原液进行稀释，调节蛋白浓度为20～25g/l，ph 7～7.5，使用0.45um滤芯过滤后制得配液半成品；

17、11.分装及冻干：将配液半成品除菌分装至50ml注射剂瓶，冷冻干燥，制得人纤维蛋白原冻干粉；

18、12.干热法灭活病毒：所述人纤维蛋白原冻干粉置于干热灭菌器中，99～101℃温度条件下灭活30min，最终得到高纯人纤维蛋白原制剂成品。

19、进一步的，所述的步骤2中的溶解缓冲液i为含氯化钠10～20g/kg、柠檬酸钠10～20g/kg、蔗糖10～20g/kg、三羟甲基氨基甲烷5～10g/kg、盐酸赖氨酸5～10g/kg，ph为6.8～7.5的溶解缓冲液i；优选为含氯化钠8g/kg、柠檬酸钠15g/kg、蔗糖15g/kg、三羟甲基氨基甲烷5.2g/kg、盐酸赖氨酸2.4g/kg，调整ph至6.8～7.5。

20、进一步的，所述的步骤7中的溶解缓冲液ii为含氯化钠10～20g/kg、柠檬酸钠10～20g/kg、蔗糖10～20g/kg、三羟甲基氨基甲烷5～10g/kg，ph为6.8～7.5的溶解缓冲液ii；优选为含氯化钠8g/kg、柠檬酸钠15g/kg、蔗糖15g/kg、三羟甲基氨基甲烷5.2g/kg，调整ph至6.8～7.5。

21、进一步的，所述的步骤9中的溶解缓冲液iii为含氯化钠1～2g/kg、柠檬酸钠10～20g/kg、甘氨酸10～50g/kg、盐酸赖氨酸10～50g/kg，ph为6.8～7.5的溶解缓冲液iii；优选为含氯化钠2g/kg、枸橼酸钠10g/kg、甘氨酸10g/kg、盐酸精氨酸15g/kg，ph为6.8～7.5。

22、进一步的，所述步骤3.(4)中的离子交换层析凝胶为阴离子交换层析凝胶；优选使用deae-650m离子交换层析凝胶，凝胶用量为0.5ml/kg血浆。

23、进一步的，所述步骤10中的活性保护剂为盐、糖、氨基酸混合保护剂；优选的，所述活性保护剂为蔗糖，赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，枸橼酸钠混合保护剂；更优选的，所述活性保护剂为含蔗糖10～20g/kg，甘氨酸10～20g/kg、盐酸赖氨酸15～30g/kg，枸橼酸钠20mmol/l的混合保护剂。

24、进一步的，所述的步骤10中的稀释液为含氯化钠1～2g/kg、柠檬酸钠10～20g/kg、甘氨酸10～50g/kg、盐酸赖氨酸10～50g/kg，ph为6.8～7.5的稀释液；优选为含氯化钠2g/kg、枸橼酸钠10g/kg、甘氨酸10g/kg、盐酸精氨酸15g/kg，ph为6.8～7.5。

25、一种根据本发明所述的从cohn组分i沉淀及人凝血因子ⅷ层析弃液中提取人纤维蛋白原的方法制得的人纤维蛋白原产品。

26、与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、1.目前国内常规生产工艺多以组分i沉淀为原料，采用两步乙醇沉淀法或两步甘氨酸沉淀法分离人纤维蛋白原制品。然而由于单一蛋白沉淀剂可分离的蛋白种类有限，采用两步乙醇沉淀法或两步甘氨酸沉淀法所制得的人纤维蛋白原制品纯度较低，仅为70％左右。采用层析工艺生产的人纤维蛋白原制品纯度较高，可达90％以上，但层析工艺耗时久，难以实现高效化、规模化生产。本发明采用一步甘氨酸沉淀法加一步乙醇沉淀法进行分离纯化，甘氨酸和乙醇作为两种性质不同的蛋白沉淀剂，其可分离的蛋白种类也有所不同，可形成分离谱互补效应，有效改善分离纯化效果，大大提高产品纯度。多批次产品验证结果表明，该工艺生产的人纤维蛋白原成品纯度高达95％，几乎不含人凝血因子ⅷ等杂质；同时，产品凝固活力极佳，多批次结果均在30s内，远优于2015版《中国药典》三部中纤维蛋白原纯度不低于70％和凝固时间少于60s的质量标准。

28、2.由于人纤维蛋白原分子在冷沉淀和组分i沉淀中均有分布，仅以组分i沉淀为原料无形中对冷沉淀中的人纤维蛋白原造成了浪费，其工艺收率和原料综合利用率较低，对宝贵的血浆资源造成极大浪费。以冷沉淀为原料生产人凝血因子ⅷ的过程中，由于人纤维蛋白原分子对阴离子交换凝胶吸附作用极弱，人凝血因子ⅷ层析流穿液中含有大量人纤维蛋白原成分，具备极高的回收价值。因此，本发明将人凝血因子ⅷ层析弃液并入cohn组分i沉淀中作为共同原料生产人纤维蛋白原，有效回收利用了层析弃液中的人纤维蛋白原成分，大大提高了工艺收率，全工艺产品收率可达1500瓶/吨血浆，有效地综合利用宝贵血浆资源。

29、3.由于采用了优选的蔗糖，赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，枸橼酸钠混合冻干/干热保护剂，在干热法灭活病毒过程中有效地保护了人纤维蛋白原分子的空间构象及生物活性，按照本发明所述制备方法所制得的人纤维蛋白原制剂复溶时间短，多批次产品验证结果表明，成品可于5min内复溶完毕，远优于复溶时间30min的《中国药典》标准，而且复溶效果好，复溶液澄清，仅微带乳光。

30、4.本发明人纤维蛋白原制剂生产过程中采用了具有高度成熟性、简便性与安全性的甘氨酸沉淀法+s/d法+干热法进行3步病毒灭活，相较于常规的2步病毒灭活工艺，具备更好的病毒安全性。