多肽构建体及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体地涉及一种多肽构建体及其应用。

背景技术：

1、肿瘤免疫细胞治疗现在在肿瘤治疗中已经占据着越来越重要的地位。目前已有多种效应免疫细胞，即杀伤性免疫细胞用于临床治疗，主要包括car-t细胞、tcr-t细胞、自然杀伤细胞(nature killer，nk)、car-nk细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineactivated killer cells，cik)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(dc-cik)、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、γδt细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，til)等。对天然的效应免疫细胞进行改造，导入过表达外源基因如car、tcr或其他跨膜分子编码基因或分泌型分子(如细胞因子、抗体等)编码基因是目前增强免疫效应细胞抗肿瘤效应、提升免疫细胞治疗效果的重要手段。由此引发的中靶脱瘤(on target/off tumor)效应引起的细胞因子释放综合征(crs)这一不良反应仍然是免疫细胞治疗的潜在重要风险。为解决这一问题，通常采用的手段是在免疫效应细胞中引入分子刹车元件，以期在发生不良反应时能够及时清除表达分子刹车元件的免疫效应细胞，进而提高安全性。目前已报道的分子刹车元件主要包括代谢型自杀基因hsv-tk系统、凋亡基因icasp9系统与通过细胞表面分子cd20胞外区与其抗体介导的adcc、adcp与cdc系统。cn109750067a和cn109750066a还公开了一种包括免疫抑制性抗体与tegfr的融合蛋白，其可通过在使用中施用靶向egfr的抗体药物如西妥昔单抗，通过adcc、adcp与cdc清除免疫效应细胞。

2、此外，对于过表达外源基因的免疫效应细胞，如何检测外源基因表达阳性的细胞，以及如何分选外源基因表达的细胞，目前仍然缺少比较有效的手段。对于表达产物为膜表面蛋白或跨膜蛋白的外源基因，针对不同的表达产物的胞外结构域，需要设计不同的检测体系和分选方法对这些外源基因表达阳性的细胞进行检测和/或分选，增加了检测和分选操作上的复杂度及检测结果一致性比较的难度。对于表达产物为分泌型蛋白或多肽的外源基因，如细胞因子和抗体，则仍然尚无特别好的方法对这些外源基因表达阳性的细胞进行检测和/或分选。

3、目前仍需要一种能够具有通用性的多肽分子标签，在具有分子刹车元件功能的同时还能够同时兼顾充当外源基因表达的检测和分选标签。这将对细胞治疗产品的生产质量控制及潜在的临床应用具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、本发明提供一种工程改造的多肽，其包括膜表面标签，所述膜表面标签包括claudin蛋白胞外结构域或其片段。

2、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白是claudin18，优选claudin18.2。

3、在一个或多个实施方案中，claudin蛋白胞外结构域的片段是claudin蛋白胞外抗原表位。

4、在一个或多个实施方案中，claudin18.2蛋白胞外结构域的片段包含seq id no:1所示序列；其核酸序列包含seq id no:2所示序列。

5、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签还包括位于claudin蛋白胞外结构域或其片段的n端或c端的用于与多肽的其余部分共价连接的连接片段。优选地，所述连接片段为接头或铰链区。

6、在一个或多个实施方案中，所述接头为柔性接头或刚性接头。优选地，所述刚性接头包含选自seq id no:3、5、7、9、11中的任一种或多种所示的序列。优选地，所述柔性接头包含选自seq id no:13、15、17、19中的任一种或多种所示的序列。

7、在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自以下的一种或多种：cd8的胞外铰链区、igg1 fc ch2ch3铰链区、igd铰链区、cd28胞外铰链区、igg4 fc ch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区。优选地，所述铰链区为igg1 fc ch2ch3铰链区或igg4fc ch2ch3铰链区。更优选地，所述铰链区选自seq id no:21-23中的任一种或多种。

8、在一个或多个实施方案中，所述多肽还包括膜锚定结构域。在一个或多个实施方案中，所述膜锚定结构域是跨膜区或gpi蛋白锚定区。所述膜表面标签位于膜锚定结构域的n端方向。

9、在一个或多个实施方案中，所述多肽还包括位于膜表面标签n端或c端方向的胞外识别区域。在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签和所述胞外识别区域通过所述铰链区或接头连接。所述胞外识别区域选自以下一种或多种：膜表面蛋白、嵌合抗原受体的抗原结合区、膜表面表达蛋白的功能蛋白区和信号转换受体的信号胞外区。

10、在一个或多个实施方案中，所述多肽还包括位于膜锚定结构域的c端方向的胞内效应区。所述胞内效应区包括所述嵌合抗原受体的胞内区域或所述信号转换受体的信号胞内区。

11、在一个或多个实施方案中，所述多肽是膜表面蛋白或跨膜蛋白。

12、在一个或多个实施方案中，所述多肽还包含信号肽。

13、在一个或多个实施方案中，所述多肽是嵌合抗原受体，其中膜表面标签位于嵌合抗原受体的跨膜区的n端方向。嵌合抗原受体包含靶向抗原的抗原结合区、铰链区或接头、claudin蛋白胞外结构域或其片段、跨膜区和胞内结构域。优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。优选地，所述信号肽位于所述嵌合抗原受体n端。

14、在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从n端到c端包含依次连接的抗原结合区、铰链区或接头、claudin蛋白胞外结构域或其片段、跨膜区和胞内结构域。所述胞内区包括信号传导区和共刺激区。

15、在一个或多个实施方案中，所述多肽是针对her2的嵌合抗原受体，所述针对her2的嵌合抗原受体包括抗原结合区、接头或铰链区、claudin蛋白胞外结构域或其片段、跨膜区和胞内结构域。所述抗原结合区为靶向her2的抗体或其抗原结合片段，所述claudin蛋白胞外结构域或其片段为claudin18.2蛋白胞外结构域的片段，所述跨膜区为cd28跨膜区，所述胞内区包括信号传导区和共刺激区。优选地，所述接头是柔性接头，例如whitlow 218接头。优选地，所述信号传导区为cd3zeta胞内信号区。优选地，所述共刺激区为cd28胞内共刺激区。优选地，所述针对her2的嵌合抗原受体还包括信号肽。优选地，所述信号肽为cd8信号肽。优选地，所述信号肽位于所述针对her2的嵌合抗原受体的n端。

16、在一个或多个实施方案中，所述多肽是针对her2的嵌合抗原受体，所述针对her2的嵌合抗原受体包括抗原结合区、claudin蛋白胞外结构域或其片段、接头或铰链区、跨膜区和胞内结构域。所述抗原结合区为靶向her2的抗体或其抗原结合片段，所述claudin蛋白胞外结构域或其片段为claudin18.2蛋白胞外结构域的片段，所述跨膜区为cd28跨膜区，所述胞内区包括信号传导区和共刺激区。

17、在一个或多个实施方案中，所述针对her2的嵌合抗原受体的编码序列如seq idno:24所示。

18、在一个或多个实施方案中，所述多肽是膜表面表达蛋白，包含功能蛋白区、所述膜表面标签、所述膜锚定结构域。优选地，膜表面表达蛋白从n端到c端依次包括：功能蛋白区、所述接头或铰链区、所述claudin18.2蛋白胞外结构域的片段和膜锚定结构域；或者膜表面表达蛋白从n端到c端依次包括：功能蛋白区、所述claudin18.2蛋白胞外结构域的片段、所述接头或铰链区、和膜锚定结构域。所述膜锚定结构域是跨膜区或gpi蛋白锚定区。优选地，所述功能蛋白区为定位在膜表面的蛋白。

19、在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白区为细胞因子、趋化因子或免疫抑制性配体(如tgf-β、pd-l1、cd155等)的结合结构域(如相应受体)，或它们的功能片段。所述细胞因子优选为il-7。

20、在一个或多个实施方案中，所述膜表面表达蛋白为膜表面il-7，所述膜表面il-7包括il-7、接头或铰链区、claudin蛋白胞外结构域或其片段和gpi蛋白锚定区。优选地，所述claudin蛋白胞外结构域或其片段为claudin18.2蛋白胞外结构域的片段，所述gpi蛋白锚定区为cd52胞外区。优选地，所述膜表面il-7还包括信号肽。优选地，所述信号肽为il-7信号肽。优选地，所述信号肽位于所述膜表面il-7的n端。优选地，所述接头是刚性接头，例如seq id no:11所示的序列。

21、在一个或多个实施方案中，所述膜表面表达蛋白的编码序列如seq id no:25所示。

22、在一个或多个实施方案中，所述多肽是信号转换受体，其中膜表面标签位于信号转换受体的跨膜区的n端方向。信号转换受体包含所述膜表面标签、铰链区或接头、信号胞外区、跨膜区和信号胞内区。信号胞外区是识别胞外信号的胞外区。信号胞内区是识别与所述胞外信号不同的信号的受体的胞内区。

23、在一个或多个实施方案中，信号胞外区是免疫抑制性配体的结合结构域。

24、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从n端到c端依次为膜表面标签、铰链区或接头、信号胞外区、跨膜区和信号胞内区。

25、在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体是tigit信号转换受体，包括claudin蛋白胞外结构域或其片段、接头或铰链区、tigit胞外区、跨膜区和胞内区。优选地，所述claudin蛋白胞外结构域或其片段为claudin18.2蛋白胞外结构域的片段。优选地，所述接头是柔性接头，例如seq id no:17所示的序列。优选地，所述跨膜区为cd226跨膜区。优选地，所述胞内区是cd226胞内区。

26、本发明第二方面提供一种包含标签区的多肽构建体，所述标签区包括膜表面标签和跨膜区，所述膜表面标签包括claudin蛋白胞外结构域或其片段，所述多肽构建体还包括位于标签区n端或c端的用于与其他多肽共价连接的可切割接头。

27、在一个或多个实施方案中，所述多肽构建体还包括信号肽。

28、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白是claudin18，优选claudin18.2。

29、在一个或多个实施方案中，claudin蛋白胞外结构域的片段是claudin蛋白胞外抗原表位。

30、在一个或多个实施方案中，claudin18.2蛋白胞外结构域的片段包含seq id no:1所示序列；其核酸序列包含seq id no:2所示序列。

31、在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为claudin18.2跨膜区。

32、在一个或多个实施方案中，所述可切割接头为选自t2a、e2a、p2a、f2a和弗林(furin)酶切割位点中的任一种。

33、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签还包括位于claudin蛋白胞外结构域或其片段的n端或c端的连接片段。优选地，所述连接片段为接头或铰链区。

34、在一个或多个实施方案中，所述接头为柔性接头或刚性接头。优选地，所述刚性接头包含选自seq id no:3、5、7、9、11中的任一种或多种所示的序列。优选地，所述柔性接头包含选自seq id no:13、15、17、19中的任一种或多种所示的序列。

35、在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自以下的一种或多种：cd8的胞外铰链区、igg1 fc ch2ch3铰链区、igd铰链区、cd28胞外铰链区、igg4 fc ch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区。优选地，所述铰链区为igg1 fc ch2ch3铰链区或igg4fc ch2ch3铰链区。更优选地，所述铰链区选自seq id no:21-23中的任一种或多种。

36、在一个或多个实施方案中，所述其他多肽位于膜表面标签的n端或c端。

37、在一个或多个实施方案中，所述标签区从n端至c端依次包括claudin18.2蛋白胞外结构域的片段、所述连接片段、跨膜区。

38、在一个或多个实施方案中，所述标签区从n端至c端依次包括连接片段、claudin18.2蛋白胞外结构域的片段、跨膜区。

39、本发明还提供一种核酸分子，包含选自以下的序列：

40、(1)本文任一实施方案所述的多肽或多肽构建体的编码序列或其作为扩增引物或检测探针的片段，

41、(2)与(1)具有至少80％序列相同性的变体，

42、(3)(1)或(2)的互补序列；

43、(4)包含外源编码序列和通过多重表达接头与所述外源编码序列相连接的膜表面标签的表达框的核酸。

44、在一个或多个实施方案中，所述多重表达接头包括：能在体内被切割的多肽接头序列的编码序列，和/或核糖体内部进入位点(ires)序列。

45、在一个或多个实施方案中，所述外源编码序列包括选自以下的任一种或多种：嵌合抗原受体编码序列、功能蛋白区编码序列和信号转换受体编码序列。所述嵌合抗原受体、功能蛋白区、信号转换受体如本文他处所述。

46、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签编码序列和所述外源编码序列通过能在体内被切割的多肽接头序列的编码序列所连接。优选地，所述能在体内被切割的多肽接头序列包括选自f2a、p2a、t2a和e2a的序列。

47、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签编码序列和所述外源编码序列通过ires的dna序列连接。优选地，所述ires包括选自hcv ires、emcv ires、fmdv ires、逆转录病毒ires和小rna病毒ires中的任一种或多种。

48、在一个或多个实施方案中，核酸分子是含有所述膜表面标签编码序列和所述外源编码序列的融合序列。

49、本发明另一方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物：

50、(1)表达本文任一实施方案所述的多肽或多肽构建体，和/或

51、(2)包含本文所述的核酸分子。

52、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

53、本发明另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含、表达和/或分泌本文所述的多肽或多肽构建体。

54、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞包含本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物。

55、本发明另一方面提供一种药物组合物，包括本文任一实施方案所述的多肽或多肽构建体、核酸分子、核酸构建物和宿主细胞中的任意一种或多种和药学上可接受的载体。

56、本发明另一方面提供膜表面标签作为分子刹车元件、分子接头、识别元件、或诱导adcc、adcp和/或cdc效应的用途，所述膜表面标签包括claudin蛋白胞外结构域或其片段。

57、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白是claudin18，优选claudin18.2。

58、在一个或多个实施方案中，claudin蛋白胞外结构域的片段是claudin蛋白胞外抗原表位。

59、在一个或多个实施方案中，claudin18.2蛋白胞外结构域的片段包含seq id no:1所示序列；其核酸序列包含seq id no:2所示序列。

60、在一个或多个实施方案中，所述识别元件是检测标签或分选标签。

61、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白胞外结构域或其片段的n端或c端连接有用于与其他多肽共价连接的连接片段。优选地，所述连接片段为接头或铰链区。

62、在一个或多个实施方案中，所述接头为柔性接头或刚性接头。优选地，所述刚性接头包含选自seq id no:3、5、7、9、11中的任一种或多种所示的序列。优选地，所述柔性接头包含选自seq id no:13、15、17、19中的任一种或多种所示的序列。

63、在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自以下的一种或多种：cd8的胞外铰链区、igg1 fc ch2ch3铰链区、igd铰链区、cd28胞外铰链区、igg4 fc ch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区。优选地，所述铰链区为igg1 fc ch2ch3铰链区或igg4fc ch2ch3铰链区。更优选地，所述铰链区选自seq id no:21-23中的任一种或多种。

64、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签通过其c端方向的膜锚定结构域锚定于细胞膜。在一个或多个实施方案中，所述膜锚定结构域是跨膜区或gpi蛋白锚定区。

65、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签通过能在体内被切割的多肽接头序列与外源基因表达蛋白相连接。所述多肽接头序列可以是能在体内被切割的任何多肽序列，例如包括但不限于f2a、p2a、t2a和e2a序列。

66、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签与所述外源基因表达蛋白的编码序列在dna水平和rna水平共价连接，形成编码所述膜表面标签基因与所述外源基因的融合基因表达框。优选地，所述共价连接是通过所述能在体内被切割的多肽接头的dna序列或rna序列连接，或通过核糖体内部进入位点(ires)的dna序列或rna序列连接。

67、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签的n端或c端连接有胞外识别区域。胞外识别区域选自以下一种或多种：嵌合抗原受体的抗原结合区、膜表面表达蛋白的功能蛋白区、或信号转换受体的信号胞外区。

68、在一个或多个实施方案中，所述膜锚定结构域的c端连接有胞内效应区。胞内效应区包括嵌合抗原受体的胞内区域或信号转换受体的信号胞内区。

69、本发明还提供本文任一实施方案所述多肽或多肽构建物、核酸分子或核酸构建物在诱导细胞adcc、adcp或cdc效应、诱导免疫刹车、识别细胞中的用途。

70、在一个或多个实施方案中，所述细胞是本文任一实施方案所述的宿主细胞。

71、本发明还提供一种诱导adcc、adcp或cdc效应、或诱导免疫刹车的方法，包括：用针对膜表面标签的能介导细胞adcc、adcp或cdc作用的抗体(例如igg)与细胞表面具有膜表面标签的细胞接触，所述膜表面标签包括claudin蛋白胞外结构域或其片段。

72、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白是claudin18，优选claudin18.2。

73、在一个或多个实施方案中，claudin蛋白胞外结构域的片段是claudin蛋白胞外抗原表位。

74、在一个或多个实施方案中，claudin18.2蛋白胞外结构域的片段包含seq id no:1所示序列；其核酸序列包含seq id no:2所示序列。

75、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签通过其c端方向的膜锚定结构域锚定在细胞表面。

76、在一个或多个实施方案中，所述细胞表达有本文所述的多肽或多肽构建体。

77、本发明还提供一种识别、检测、分选细胞的方法，包括：用针对膜表面标签的抗体与细胞表面具有膜表面标签的细胞接触，所述膜表面标签包括claudin蛋白胞外结构域或其片段。

78、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白是claudin18，优选claudin18.2。

79、在一个或多个实施方案中，claudin蛋白胞外结构域的片段是claudin蛋白胞外抗原表位。

80、在一个或多个实施方案中，claudin18.2蛋白胞外结构域的片段包含seq id no:1所示序列；其核酸序列包含seq id no:2所示序列。

81、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签通过其c端方向的膜锚定结构域锚定在细胞表面。

82、在一个或多个实施方案中，所述细胞表达有本文所述的多肽或多肽构建体。

83、本发明优点：claudin18.2抗原表位片段长度较短，对于外源基因影响较小，是优异的检测和分选标签。另外在抗体存在下能够有效介导adcc和cdc效应，及时杀伤含有claudin18.2抗原表位的细胞。