水稻籽粒镉含量相关基因LCd7的联合单倍型分子标记及其应用

本发明属于生物，具体涉及水稻籽粒镉含量相关基因lcd7的联合单倍型分子标记及其应用。

背景技术：

1、水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。农田重金属污染是当今世界面临的重大环境问题,受到各界广泛关注。重金属污染具有复杂隐蔽性、危害持久性,尤其可能通过食物链的富集作用危及人类健康。其中镉是对环境毒性最大的重金属元素之一,对水稻等粮食作物的安全生产构成严重威胁。

2、镉对有机体有极强的毒害作用，尤其在人类身体中，其半排出周期长达30年，长期摄取被镉污染的稻米，会增加患肺癌、肾脏和肝脏疾病以及痛痛病的几率。粮食作物的安全问题与人类健康息息相关，但镉污染农田治理周期长难度大，因此，如何在不浪费现有农田的基础上，生产出安全的粮食作物显得尤为重要。

3、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单倍型(haplotype)则是位于一条染色体上某一区域的一组相关联的多个snp等位位点。单核苷酸多态性标记具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定水稻镉累积性状或如何鉴定或辅助鉴定水稻籽粒的镉含量或如何进行水稻育种。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种应用，所述应用为下述p1、p2或p3，

3、所述p1为检测tagsnp-14208267的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻镉含量中的应用，所述tagsnp-14208267是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列1的第19位核苷酸，其为a或c；

4、所述p2为检测tagsnp-14208267和6个snp的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻镉含量中的应用，所述6个snp分别为oscd1-tagsnp-840593、oshma2-tagsnp-29481835、oshma3-tagsnp-7406920、osmtp1-tagsnp-1679325、osnramp1-tagsnp-8965009和osnramp5-tagsnp-8880395：

5、所述oscd1-tagsnp-840593是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列2的第24位核苷酸，其为g或a；

6、所述oshma2-tagsnp-29481835是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列3的第25位核苷酸，其为g或a；

7、所述oshma3-tagsnp-7406920是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列4的第19位核苷酸，其为g或a；

8、所述osmtp1-tagsnp-1679325是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列5的第30位核苷酸，其为g或a；

9、所述osnramp1-tagsnp-8965009是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列6的第26位核苷酸，其为c或a；

10、所述osnramp5-tagsnp-8880395是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列7的第22位核苷酸，其为c或t；

11、所述p3为检测联合单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻镉含量中的应用，所述联合单倍型是水稻染色体上所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性组合。

12、为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种应用，所述应用为q1、q2或q3：

13、所述q1为检测tagsnp-14208267的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定水稻镉含量产品中的应用，所述tagsnp-14208267是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列1的第19位核苷酸，其为a或c；

14、所述q2为检测tagsnp-14208267和其他6个snp的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定水稻镉含量产品中的应用，所述6个snp分别为oscd1-tagsnp-840593、oshma2-tagsnp-29481835、oshma3-tagsnp-7406920、osmtp1-tagsnp-1679325、osnramp1-tagsnp-8965009和osnramp5-tagsnp-8880395：

15、所述oscd1-tagsnp-840593是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列2的第24位核苷酸，其为g或a；

16、所述oshma2-tagsnp-29481835是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列3的第25位核苷酸，其为g或a；

17、所述oshma3-tagsnp-7406920是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列4的第19位核苷酸，其为g或a；

18、所述osmtp1-tagsnp-1679325是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列5的第30位核苷酸，其为g或a；

19、所述osnramp1-tagsnp-8965009是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列6的第26位核苷酸，其为c或a；

20、所述osnramp5-tagsnp-8880395是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列7的第22位核苷酸，其为c或t；

21、所述q3为检测联合单倍型的物质在制备鉴定或辅助鉴定水稻镉含量产品中的应用，所述联合单倍型是水稻染色体上所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性组合。

22、为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述e1、e2或e3的应用：

23、所述e1为检测tagsnp-14208267的多态性或基因型的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用，所述tagsnp-14208267是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列1的第19位核苷酸，其为a或c。

24、所述e2为检测tagsnp-14208267和其他6个snp的多态性或基因型的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用，所述6个snp分别为oscd1-tagsnp-840593、oshma2-tagsnp-29481835、oshma3-tagsnp-7406920、osmtp1-tagsnp-1679325、osnramp1-tagsnp-8965009和osnramp5-tagsnp-8880395：

25、所述oscd1-tagsnp-840593是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列2的第24位核苷酸，其为g或a；

26、所述oshma2-tagsnp-29481835是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列3的第25位核苷酸，其为g或a；

27、所述oshma3-tagsnp-7406920是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列4的第19位核苷酸，其为g或a；

28、所述osmtp1-tagsnp-1679325是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列5的第30位核苷酸，其为g或a；

29、所述osnramp1-tagsnp-8965009是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列6的第26位核苷酸，其为c或a；

30、所述osnramp5-tagsnp-8880395是水稻基因组的一个snp，为序列表中序列7的第22位核苷酸，其为c或t。

31、所述e3为检测联合单倍型的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用，所述联合单倍型是水稻染色体上所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性组合。

32、为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述检测水稻基因组tagsnp-14208267多态性或基因型的产品或含有上述检测水稻基因组所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性或基因型的物质的产品或含有权利要求1中所述检测联合单倍型的物质的产品，且可为下述g1)-g3)中的任一种：

33、g1)检测水稻镉含量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

34、g2)鉴定或辅助鉴定水稻镉含量的产品；

35、g3)用于水稻育种的产品。

36、为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定水稻镉含量的方法，所述方法包括方法a、方法b:

37、所述方法a为检测待测水稻中水稻基因组tagsnp-14208267多态性或基因型，根据所述待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻镉含量：所述tagsnp-14208267的基因型为aa的水稻的镉含量低于或候选低于所述tagsnp-14208267的基因型为cc的水稻，所述aa是tagsnp-14208267为a的纯合型；所述cc是tagsnp-14208267为c的纯合型；

38、所述方法b为检测待测水稻中水稻基因组所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性或基因型，根据所述待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻镉含量：所述7个snp的基因型为基因型aaaaaaggccttaa的水稻的籽粒镉含量低于或候选低于所述7个snp的基因型为基因型ggggggaaaacccc或基因型ggggaaggccttaa的水稻。

39、所述基因型aaaaaaggccttaa的水稻为oscd1-tagsnp-840593的基因型为aa，且oshma2-tagsnp-29481835的基因型为aa，且oshma3-tagsnp-7406920的基因型为aa，且osmtp1-tagsnp-1679325的基因型为gg，且osnramp1-tagsnp-8965009的基因型为cc，且osnramp5-tagsnp-8880395的基因型为tt，且tagsnp-14208267的基因型为aa的7个snp的组合基因型；

40、所述基因型ggggggaaaacccc的水稻为oscd1-tagsnp-840593的基因型为gg，且oshma2-tagsnp-29481835的基因型为gg，且oshma3-tagsnp-7406920的基因型为gg，且osmtp1-tagsnp-1679325的基因型为aa，且osnramp1-tagsnp-8965009的基因型为aa，且osnramp5-tagsnp-8880395的基因型为cc，且tagsnp-14208267的基因型为cc的7个snp的组合基因型；

41、所述基因型ggggaaggccttaa的水稻为oscd1-tagsnp-840593的基因型为gg，且oshma2-tagsnp-29481835的基因型为gg，且oshma3-tagsnp-7406920的基因型为aa，且osmtp1-tagsnp-1679325的基因型为gg，且osnramp1-tagsnp-8965009的基因型为cc，且osnramp5-tagsnp-8880395的基因型为tt，且tagsnp-14208267的基因型为aa的7个snp的组合基因型。

42、上述鉴定或辅助鉴定水稻镉含量的方法在在水稻育种中的应用也属于本发明的保护范围。

43、本发明还提供了一种水稻育种的方法，所述方法包括方法a、方法b:

44、所述方法a为检测待测水稻中上述检测水稻基因组tagsnp-14208267多态性或基因型，选择tagsnp-14208267的基因型为aa的纯合型水稻作为亲本育种；

45、所述方法b为检测待测水稻中上述检测水稻基因组所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性或基因型，选择所述7个snp的基因型为基因型aaaaaaggccttaa的水稻作为亲本进行育种，所述基因型aaaaaaggccttaa的水稻为oscd1-tagsnp-840593的基因型为aa，且oshma2-tagsnp-29481835的基因型为aa，且oshma3-tagsnp-7406920的基因型为aa，且osmtp1-tagsnp-1679325的基因型为gg，且osnramp1-tagsnp-8965009的基因型为cc，且osnramp5-tagsnp-8880395的基因型为tt，且tagsnp-14208267的基因型为aa的7个snp的组合基因型。

46、上文所述待测水稻为水稻自交系，上文所述应用中，选择水稻的自交系作为亲本进行育种。

47、上述应用及方法中，所述水稻育种的目的包括培育低镉含量水稻或选育镉含量低的水稻品种。

48、上述应用、方法及产品中，所述检测所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267这7个snp的多态性或基因型的物质，或所述检测联合单倍型的物质可为如下d1)、d2)、d3)或d4)：

49、d1)含有扩增包括上述tagsnp-14208267在内的水稻基因组dna片段的pcr引物；

50、d2)含有扩增包括权利要求1中所述oscd1-tagsnp-840593、所述oshma2-tagsnp-29481835、所述oshma3-tagsnp-7406920、所述osmtp1-tagsnp-1679325、所述osnramp1-tagsnp-8965009、所述osnramp5-tagsnp-8880395和所述tagsnp-14208267在内的水稻基因组dna片段的pcr引物；

51、d3)含有d1)或d2)所述pcr引物的pcr试剂；

52、d4)含有d1)或d2)所述pcr引物或d3)所述pcr试剂的试剂盒。

53、上述应用或产品或方法中，所述pcr引物含有述tagsnp-14208267引物组或7引物组：

54、1)所述tagsnp-14208267引物组由tagsnp-14208267-a和tagsnp-14208267-b和tagsnp-14208267-c组成；

55、引物tagsnp-14208267-a为核苷酸序列是序列表中序列8的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列8的第22-40位的单链dna；

56、引物tagsnp-14208267-b为核苷酸序列是序列表中序列9的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列9的第22-39位的单链dna；

57、引物tagsnp-14208267-c为核苷酸序列是序列表中序列10的单链dna分子；

58、2)所述7引物组由所述tagsnp-14208267引物组、所述oscd1-tagsnp-840593引物组、所述oshma2-tagsnp-29481835引物组、所述oshma3-tagsnp-7406920引物组、所述osmtp1-tagsnp-1679325引物组、所述osnramp1-tagsnp-8965009引物组和所述osnramp5-tagsnp-8880395引物组构成，

59、所述oscd1-tagsnp-840593引物组由引物oscd1-tagsnp-840593-a、oscd1-tagsnp-840593-b和oscd1-tagsnp-840593-c组成；

60、引物oscd1-tagsnp-840593-a为核苷酸序列是序列表中序列11的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列11的第22-44位的单链dna；

61、引物oscd1-tagsnp-840593-b为核苷酸序列是序列表中序列12的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列12的第22-45位的单链dna；

62、引物oscd1-tagsnp-840593-c为核苷酸序列是序列表中序列13的单链dna分子；

63、所述oshma2-tagsnp-29481835引物组由引物oshma2-tagsnp-29481835-a、oshma2-tagsnp-29481835-b和oshma2-tagsnp-29481835-c组成；

64、引物oshma2-tagsnp-29481835-a为核苷酸序列是序列表中序列14的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列14的第22-46位的单链dna；

65、引物oshma2-tagsnp-29481835-b为核苷酸序列是序列表中序列15的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列15的第22-48位的单链dna；

66、引物oshma2-tagsnp-29481835-c为核苷酸序列是序列表中序列16的单链dna分子；

67、所述oshma3-tagsnp-7406920引物组由引物oshma3-tagsnp-7406920-a、oshma3-tagsnp-7406920-b和oshma3-tagsnp-7406920-c组成；

68、引物oshma3-tagsnp-7406920-a为核苷酸序列是序列表中序列17的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列17的第22-40位的单链dna；

69、引物oshma3-tagsnp-7406920-b为核苷酸序列是序列表中序列18的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列18的第22-39位的单链dna；

70、引物oshma3-tagsnp-7406920-c为核苷酸序列是序列表中序列19的单链dna分子；

71、所述osmtp1-tagsnp-1679325引物组由引物osmtp1-tagsnp-1679325-a、osmtp1-tagsnp-1679325-b和osmtp1-tagsnp-1679325-c组成；

72、引物osmtp1-tagsnp-1679325-a为核苷酸序列是序列表中序列20的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列20的第22-51位的单链dna；

73、引物osmtp1-tagsnp-1679325-b为核苷酸序列是序列表中序列21的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列21的第22-50位的单链dna；

74、引物osmtp1-tagsnp-1679325-c为核苷酸序列是序列表中序列22的单链dna分子；

75、所述osnramp1-tagsnp-8965009引物组由引物osnramp1-tagsnp-8965009-a、osnramp1-tagsnp-8965009-b和osnramp1-tagsnp-8965009-c组成；

76、引物osnramp1-tagsnp-8965009-a为核苷酸序列是序列表中序列23的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列23的第22-47位的单链dna；

77、引物osnramp1-tagsnp-8965009-b为核苷酸序列是序列表中序列24的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列24的第22-49位的单链dna；

78、引物osnramp1-tagsnp-8965009-c为核苷酸序列是序列表中序列25的单链dna分子；

79、所述osnramp5-tagsnp-8880395引物组由引物osnramp5-tagsnp-8880395-a、osnramp5-tagsnp-8880395-b和osnramp5-tagsnp-8880395-c组成；

80、引物osnramp5-tagsnp-8880395-a为核苷酸序列是序列表中序列26的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列26的第22-43位的单链dna；

81、引物osnramp5-tagsnp-8880395-b为核苷酸序列是序列表中序列27的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列27的第22-41位的单链dna；

82、引物osnramp5-tagsnp-8880395-c为核苷酸序列是序列表中序列28的单链dna分子。

83、上述应用、方法中，所述检测tagsnp-14208267、oscd1-tagsnp-840593、oshma2-tagsnp-29481835、oshma3-tagsnp-7406920、osmtp1-tagsnp-1679325、osnramp1-tagsnp-8965009和osnramp5-tagsnp-8880395这7个snp的多态性或基因型的物质，或所述检测联合单倍型的物质，可为通过下述至少一种方法确定上述水稻基因组中tagsnp-14208267、oscd1-tagsnp-840593、oshma2-tagsnp-29481835、oshma3-tagsnp-7406920、osmtp1-tagsnp-1679325、osnramp1-tagsnp-8965009和osnramp5-tagsnp-8880395这7个位点的核苷酸种类：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。

84、上述应用和方法中，所述pcr引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

85、上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parms master mix试剂、酶标仪和在线软件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由pcr引物、parms master mix试剂、在线软件snp decoder和荧光定量pcr仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测水稻基因组中tagsnp-14208267、oscd1-tagsnp-840593、oshma2-tagsnp-29481835、oshma3-tagsnp-7406920、osmtp1-tagsnp-1679325、osnramp1-tagsnp-8965009和osnramp5-tagsnp-8880395这7个snp的多态性或基因型的物质。

86、上述应用、方法中，所述镉含量低的水稻品种中的镉含量是相对于杂交亲本水稻而言。如果两个杂交亲本水稻的镉含量相同，所述低镉含量水稻品种的镉含量可等于或低于杂交亲本水稻的镉含量；如果两个杂交亲本水稻的镉含量不相同，所述低镉含量水稻品种的镉含量可等于或低于两个杂交亲本水稻中镉含量较高的杂交亲本水稻。

87、本发明提供了一个lcd7基因的snp分子标记鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量，采用分子标记辅助选择育种可在dna水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可以在苗期进行选择，降低表型评价的成本，提高育种效率。同时，可以利用lcd7基因的snp位点与其它六个水稻籽粒镉积累相关基因的联合单倍型辅助鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量。