一种哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体及其制备方法和用途

本发明涉及一种哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体，尤其是涉及一种哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体及其制备方法和用途。

背景技术：

1、哈维氏弧菌(vibrio harveyi)是鱼类养殖生产中常见的革兰氏阴性致病微生物，其细胞外部所特有的外膜蛋白(outer membrane proteins，omps)，例如ompk，在维持细胞结构、物质能量交换、病原侵染等生理活动上具有重要作用。因此，制备特异性的ompk抗体，对于哈维氏弧菌的快速诊断与防治具有重要意义。

2、抗体是b淋巴细胞合成分泌的一类大分子蛋白，由两条相同的重链、两条相同的轻链通过链间(内)二硫键相连而成。在b淋巴细胞发育分化的过程中，抗体轻、重链的v-(d)-j基因序列发生随机重排，最终在每一个b淋巴细胞膜上表达一个独特的抗体蛋白。现有的哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体的制备方法采用杂交瘤细胞技术，包括以下步骤：1)重组表达的哈维氏弧菌ompk蛋白免疫小鼠；2)将免疫后小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过化学诱导剂聚乙二醇(peg)进行诱导融合成为杂交瘤细胞；3)融合后的杂交瘤细胞克隆至96孔板中；4)elisa法筛选能够分泌阳性抗体的杂交瘤细胞；5)对杂交瘤细胞进行亚克隆；6)筛选获得能够分泌特异性抗体的单一克隆的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞分泌的抗体，随着杂交瘤细胞的传代增殖，杂交瘤细胞的抗体序列也有可能发生突变，从而导致不同批次抗体的均一性较差。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高特异性、高亲和度以及均一性、稳定性好的哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体及其制备方法和用途。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体，其特征在于：包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区的氨基酸序列为seq idno：1所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:2所示。

3、进一步，所述的重链可变区的第一轮上游扩增引物序列为5’-gggaattcgaggtgcagctgcaggagtctgg-3’，第一轮下游扩增引物序列为5’-ggaaggtgtgcacaccgctggac-3’；所述的重链可变区的第二轮上游扩增引物序列为5’-gggaattcgaggtgcagctgcaggagtctgg-3’，第二轮下游扩增引物序列为5’-gctcagggaaatagcccttgac-3’。

4、进一步，所述的轻链可变区的第一轮上游扩增引物序列为5’-tgctgctgctctgggttccag-3’，第一轮下游扩增引物序列为5’-gatggtgggaagatggatacagtt-3’；所述的轻链可变区的第二轮上游扩增引物序列为5’-gayattgtgmtsacmcarwctmca-3’，第二轮下游扩增引物序列为5’-gccaccgtacgtttcagctccagcttggtc-3’。

5、上述哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)重组表达的哈维氏弧菌ompk蛋白的制备；

7、(2)免疫磁珠法分离富集小鼠脾脏b淋巴细胞；

8、(3)将荧光蛋白标记的ompk蛋白与分离富集的小鼠脾脏b淋巴细胞体外孵育得到悬浮淋巴细胞液；

9、(4)通过流式细胞术高通量筛选单个fitc阳性b淋巴细胞；

10、(5)单细胞rt-pcr技术扩增fitc阳性b淋巴细胞的抗体序列；

11、(6)将抗体序列克隆至表达载体并在工程细胞系hek293细胞上合成表达，获得哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体。

12、进一步，步骤(1)所述的重组表达的哈维氏弧菌ompk蛋白的制备具体步骤如下：

13、a.设计ompk外膜蛋白特异性引物，扩增ompk片段并构建pgex-2t-ompk重组表达质粒，其中上游引物5’-ggatcc gctgactactcagacggcg-3’；下游引物5’-gaattcttagaacttgtaagttactgc-3’；

14、b.将pgex-2t-ompk重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中，通过氨苄霉素、菌落pcr法筛选出含有目的基因的大肠杆菌，其中上游筛选引物为5’-gctgactactcagacggcg-’，下游筛选引物5’-ttagaacttgtaagttactgc-3’；

15、c.将含有目的基因的大肠杆菌在lb培养基中，于37℃，220rpm培养，然后加入0.1mm iptg低温过夜诱导表达；次日，离心收集大肠杆菌并用预冷pbs缓冲液清洗3次，随后用10ml预冷裂解液重悬，并置于冰上超声破碎5min后离心收集上清液；将上清液缓慢加入gst纯化柱中，待柱子平衡后，加入预冷裂解液洗去杂蛋白，随后加入50mm还原型谷胱甘肽溶液进行洗脱，收集重组表达的ompk蛋白，透析后收集得到重组表达的哈维氏弧菌ompk蛋白。

16、进一步，步骤(2)所述的免疫磁珠法分离富集小鼠脾脏b淋巴细胞具体步骤如下：

17、a.将50μg纯化后的ompk蛋白溶解于200μl磷酸缓冲液中得到ompk蛋白溶液，将ompk蛋白溶液与弗氏完全佐剂按照1:1体积比充分混合，随后皮下多点注射免疫小鼠；初次免疫两周后，将ompk蛋白溶液与弗氏不完全佐剂按照1:1体积比充分混合，随后皮下多点注射进行二次免疫；一周后，将200μg纯化后的ompk蛋白溶于400μl磷酸缓冲液中，尾静脉注射加强免疫；

18、b.加强免疫后3天，将免疫小鼠的脾脏剪成1mm大小组织块，用注射针栓于100目金属网筛上轻轻研磨，之后经hanks溶液洗涤过筛后制成单细胞悬液，离心弃去上清后，加入5ml红细胞裂解液，反应30min后，加入25ml磷酸缓冲液，离心弃去上清并用80μl磷酸缓冲液重悬后，加入20μl包被有cd19抗体的磁性纳米颗粒，室温孵育15min后，加入1ml磷酸缓冲液，离心弃去上清后用500μl磷酸缓冲液重悬，将细胞悬液缓慢加入置于磁力架上的磁力柱中，并用1.5ml磷酸缓冲液清洗2次，随后移去磁力架，用500μl磷酸缓冲液洗脱收集目标细胞，即得到小鼠脾脏b淋巴细胞。

19、进一步，步骤(3)所述的荧光蛋白标记的ompk蛋白与小鼠脾脏b淋巴细胞体外孵育具体步骤如下：将重组表达的哈维氏弧菌ompk蛋白溶于磷酸缓冲液中至浓度1mg/ml，加入fitc荧光染料使其终浓度为100μg/ml，室温下孵育4小时，超滤离心并收集fitc标记的ompk蛋白，得到fitc标记的重组ompk蛋白，命名为fitc-ompk蛋白；随后将50μg的fitc-ompk蛋白加入1×108个/ml的小鼠脾脏b淋巴细胞，冰上孵育30min后，磷酸缓冲液清洗三次后，重悬于200μl磷酸缓冲液中，得到悬浮淋巴细胞液。

20、进一步，步骤(5)所述的单细胞rt-pcr技术扩增fitc阳性b淋巴细胞的抗体序列具体步骤如下：将筛选单个fitc阳性b淋巴细胞进行反转录得到cdna为模版分别用于重链及轻链可变区的扩增，所述的重链可变区的第一轮上游扩增引物序列为5’-gggaattcgaggtgcagctgcaggagtctgg-3’，第一轮下游扩增引物序列为5’-ggaaggtgtgcacaccgctggac-3’；所述的重链可变区的第二轮上游扩增引物序列为5’-ggaattcgaggtgcagctgcaggagtctgg-3’，第二轮下游扩增引物序列为5’-gctcagggaaatagcccttgac-3’；所述的轻链可变区的第一轮上游扩增引物序列为5’-tgctgctgctctgggttccag-3’，第一轮下游扩增引物序列为5’-gatggtgggaagatggatacagtt-3’；所述的轻链可变区的第二轮上游扩增引物序列为5’-gayattgtgmtsacmcarwctmca-3’，第二轮下游扩增引物序列为5’-gccaccgtacgtttcagctccagcttggtc-3’，pcr反应条件为95℃变性30s，迅速冷却至55℃，引物退火结合到靶序列上，随后升温至72℃，引物在模版上延伸45s，此过程循环30次。

21、进一步，步骤(6)所述的哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体ranti-ompk的制备方法具体如下：将重链、轻链可变区pcr产物进行纯化回收后，将重链可变区pcr产物克隆至abvec2.0-ighg1表达质粒中，轻链可变区pcr产物克隆至abvec1.1-igkc表达质粒中；

22、将包含轻、重链可变区序列的表达载体共转染至hek293细胞；一周后，将收集的上清液于800×g离心5min，随后加入protein a/g琼脂糖珠，分离纯化上清中的重组抗，即得到哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体ranti-ompk。

23、上述哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体在制备哈维氏弧菌抑制剂方面的用途。

24、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种哈维氏弧菌外膜蛋白重组抗体及其制备方法和用途，其筛选获得的重组抗体具有更高的灵敏度，同时重组抗体序列已知，可以保证后续大规模合成时抗体质量的高均一性、稳定性、高特异性以及高亲和度。