一种基于CRISPR技术的便携式非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用

本发明属于比色试剂研究及核酸检测，具体涉及一种基于crispr技术的便携式非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟，是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起的一种急性的家畜传染病，致死率高达100％，对我国的生猪养殖业造成了严重的打击。及时检测出并处理非洲猪瘟病毒是控制非洲猪瘟疫情传播最重要的方法之一。常规检测非洲猪瘟病毒核酸的方法为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)。该方法依据双链扩增原理，在引物、模板dna以及4种脱氧核苷酸存在时，在dna聚合酶的催化作用下，依据碱基互补配对原则，在体外实现目的dna片段的指数级扩增。pcr检测方法是世界动物卫生组织推荐用于asfv诊断的核酸检测方法，也是当前实验室较为实用的asfv鉴别诊断方法。pcr检测法具有特异性高、灵敏度高、简便快速的优点，且可实现扩增反应终点产物的定性或半定量分析。但是，这种检测方法需要专业的热循环仪，对操作人员的技术要求高，需要特定的实验室环境条件等，因而并不适用于asfv的现场快速检测。

2、crispr(clustered regularly spaced short palindromic repeats)-cas(crispr-associated)系统最初来源于原核适应性免疫系统，用于识别和降解入侵的核酸，是21世纪基因编辑领域的一项重要发明。由于其操作简单、灵敏度高、特异性强、成本低等特点，被誉为“下一代分子诊断技术”。这些核酸检测技术的发展使得病原体的快速、即时的现场诊断成为可能。近年来，基于crispr的生物传感系统发展迅速，已被广泛应用于生物标志物的检测中(xiong y,zhang j,yang z,et al.functional dna regulated crispr-cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets[j].jam chem soc,2020,142(1):207)。尤其是近年来发现的crispr/cas12a、crispr/cas13a系统，在核酸相关诊断方面显示出巨大的潜力(tian t,qiu z,jiang y,et al.exploitingthe orthogonal crispr-cas12a/cas13a trans-cleavage for dual-gene virusdetection using a handheld device[j].biosensors and bioelectronics,2022,196)。然而，目前所报导的基于crispr技术的检测方法以荧光和电化学的信号输出方式为主，不利于实现现场快速检测和分析。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种基于crispr技术的便携式非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用，可用于非洲猪瘟病毒的核酸检测，实现对非洲猪瘟病毒核酸的无需专业仪器、无需专业人员、即时、现场、准确、经济的可视化检测。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种基于crispr技术的便携式非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，包括基因编辑探针、反应液、2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和过氧化氢；所述基因编辑探针包括与非洲猪瘟核酸特征序列互补的rna序列crrna、cas12a蛋白、引发链；所述反应液包括发夹1、发夹2、氯化血红素；

4、所述crrna、cas12a蛋白，可以与靶标形成cas-crrna-靶标复合物，激活cas蛋白的切割活性，对引发链进行切割；所述crrna具有如seq id no.1所示序列；

5、所述引发链的序列与发夹1部分互补，且可以打开发夹1的茎环结构，使发夹1的茎环结构伸展为单链状态；所述引发链具有如seq id no.2所示序列；

6、所述发夹1和发夹2具有茎环结构且部分互补，在发夹1的茎环结构没有打开时，不会发生反应，当发夹1的茎环结构打开时，会触发发夹1和发夹2的杂交链式反应，造成发夹1和发夹2的连锁组装；所述发夹1具有如seq id no.3所示序列；所述发夹2具有如seq idno.4所示序列；

7、所述发夹1在茎环结构打开时，形成g-四链体基团，结合氯化血红素形成复合物，在加入过氧化氢和2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐时，发生显色反应，显色颜色为绿色，实现可视化检测。

8、优选地，还包括非洲猪瘟病毒特征靶标核酸样本、缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3；

9、所述非洲猪瘟病毒特征靶标核酸样本为非洲猪瘟病毒基因片段，是由互补配对的t1和t2组成的dna双链，所述t1和t2分别具有如seq id no.5-6所示序列；

10、所述缓冲液1为：50mm nacl，10mm tris-hcl，10mm mgcl2，100μg/ml bsa，ph＝7.9；

11、所述缓冲液2为：140mm nacl，50mm tris-hcl，1mm mgcl2，ph＝7.4；

12、所述缓冲液3为：25mm hepes，200mm nacl，20mm kcl，1％二甲基亚砜，ph＝8.0。

13、一种基于crispr技术的便携式非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

14、步骤1)向体系中加入crrna、cas12a蛋白、引发链，通过缓冲液1稀释，制成基因编辑探针；

15、步骤2)向体系中加入发夹1、发夹2、氯化血红素，通过加入体积比例为2:1的缓冲液2和缓冲液3稀释，制成反应液；

16、步骤3)将步骤1)制得的基因编辑探针、步骤2)制得的反应液，与2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和过氧化氢组成试剂盒，即得。

17、优选地，步骤1)所述cas12a蛋白的浓度为300～700nm，所述crrna的浓度为300～700nm，所述引发链的浓度为50～1000nm；步骤2)所述发夹1的浓度为100～800nm，所述发夹2的浓度为100～800nm，所述氯化血红素的浓度为2～200μm。

18、优选地，步骤1)所述cas12a蛋白的浓度为400nm，所述crrna的浓度为400nm，所述引发链的浓度为150nm；步骤2)所述发夹1的浓度为375nm，所述发夹2的浓度为375nm，所述氯化血红素的浓度为50μm。

19、上述的试剂盒，或上述制备方法制得的试剂盒在非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒核酸检测中的应用。

20、优选地，非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒核酸检测包括以下步骤：

21、步骤a)向待测样品中加入基因编辑探针，在20～45℃下反应10～60min，对引发链进行切割；

22、步骤b)向步骤a)的溶液中加入反应液，在20～45℃下反应5～30min，进行发夹1和发夹2的杂交链式反应，发夹1的茎环结构打开，形成g-四链体基团，结合氯化血红素形成复合物；

23、步骤c)向步骤b)的溶液中加入2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和过氧化氢，反应1～15min，促使2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐氧化显色；

24、步骤d)待步骤c)的反应完成，肉眼观察步骤c)中的溶液颜色变化；溶液无色则为阳性，溶液绿色则为阴性。

25、优选地，步骤a)所述反应的温度为37℃，反应的时间为30min；步骤b)所述反应的温度为37℃，反应的时间为20min；步骤c)所述反应的时间为8min，所述2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的终浓度为2mm，所述过氧化氢的终浓度为1mm。

26、本发明的有益效果如下：

27、(1)本发明通过杂交链式反应，实现了反应液中hemin/g-四链体基团的快速增加，形成了更加直观可读的检测效果对比，创新性地利用hemin/g-四链体基团在氧化氢存在时催化abts的显色反应实现可视化检测。相较于传统的核酸检测方法，本发明的试剂盒可以通过裸眼观察或比色光谱实现对目标核酸的现场即时可视化检测。

28、(2)本发明的试剂盒操作简单，反应条件温和，成本低廉，不受场地、专业人员和专业仪器限制，满足了非洲猪瘟病毒现场即时快速检测的需求，在医学诊断和现场快速检测中具有广阔的应用价值和发展前景。

29、(3)本发明的试剂盒基于crispr技术实现非洲猪瘟病毒核酸检测，具有高度特异性和灵敏度，确保了检测结果的准确性。