褐飞虱靶标融合基因NlCHS-Cht1及其具有高效致死作用的纳米共递送体系

本发明涉及害虫防治领域，具体涉及一种褐飞虱靶标融合基因nlchs-cht1及其具有高效致死作用的纳米共递送体系。

背景技术：

1、水稻是我国的第一大粮食作物，每年因病虫草为害造成的损失巨大，褐飞虱是水稻生产上危害最严重的害虫之一。褐飞虱具有远距离迁飞习性，为害发生范围广，爆发频率高，造成的经济损失十分严重。长期以来，防治褐飞虱的主要方法为化学防治。但是由于长期不科学合理使用化学杀虫剂，加速了褐飞虱抗药性进化，导致其对包括噻嗪酮在内的33种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。褐飞虱抗药性的产生，降低了多种已有化学杀虫剂的防治效果，然而加大药剂使用量会引起环境污染、农产品质量安全等一系列问题，并且新型化学杀虫剂的研发成本十分巨大，研发所需时间较长，因此，亟需开发新型高效的褐飞虱防治方法。

2、利用rnai技术抑制害虫生长发育中的关键基因是有害生物防治近年研究的热点。rnai介导的基因沉默具有特异性强、沉默效率高等优点，利用rnai技术抑制害虫生长发育中的关键基因，可阻碍害虫的正常生长发育，甚至导致其死亡，因此rnai技术在害虫防治领域具有巨大的应用潜力。以rnai为核心的害虫防治主要可以通过转基因策略和非转基因策略实现，而转基因生物监管准则还不清晰，其安全性也仍然具有很大争议，其发展存在限制。非转基因策略即利用外源dsrna防治害虫，目前在实际使用过程中存在许多问题限制rnai的效率。首先，不同昆虫中同一靶标基因的致死效果不同，这给rnai靶基因筛选增加了难度；其次，dsrna在递送过程中不稳定，容易发生降解导致rnai效率较差，并且递送剂量较少难以引起致死效果。在使用rnai技术进行害虫防治时，针对害虫体内的靶标基因的选择以及rnai效率的提高等方面还有诸多问题待解决。

3、纳米材料是指尺寸在1-100nm之间的粒子，其具有尺寸小、比表面积大、易于修饰等特点，在医学中被广泛用于药物分子和生物大分子的递送。近年来，为了提高dsrna的稳定性以及细胞的摄取效率，纳米材料也逐渐被用于昆虫dsrna的递送。已有许多研究证明使用纳米材料包裹和递送dsrna可提高其干扰效率。但在实际应用中不只需要考虑载体的递送性能，还需要考虑环境风险经济效益等因素。如合成脂质体的磷脂等原料价格昂贵，阳离子聚合物不易降解显示出较大的细胞毒性，纳米胶束在跨膜吸收方面仍存在问题等等，还需要进一步选择合适的纳米递送载体。金属有机框架(metal-organic frameworks,mofs)材料是一类由金属离子及有机配体自组装而成的多孔材料，具有孔隙率高、比表面积大和结构多样化等独特优点，其多孔结构和多个有机无机作用位点使其容易与各种生物大分子物质(如蛋白质和核酸)结合，是一种潜在的核酸载体。锌离子是一种内源性金属离子，由金属离子zn2+与咪唑或其衍生物组成的金属有机骨架为沸石咪唑骨架(zif)，其具有良好的生物相容性。最具代表性的zif是zif-8，它是由zn2+与二甲基咪唑配位形成的。zif-8不仅具有金属有机框架结构合成简单、表面易于修饰、比表面积大、孔径可调、载药能力强等优点，还具有合成原料便宜，生物相容性好，ph响应等特性，有望用于dsrna递送。

4、rnai技术与现有的杀虫剂联用可以进一步提高杀虫效果。rnai技术通过靶基因沉默，打破了昆虫的正常生长发育，协助杀虫剂突破昆虫体壁或围食膜的阻挡，增强杀虫剂的杀虫效果。噻嗪酮(buprofezin)是一类几丁质合成抑制剂，它会抑制昆虫蜕皮，影响昆虫生长发育，从而导致害虫死亡，其对许多半翅目害虫毒力较高，对非靶标的哺乳动物毒性较低，广泛用于褐飞虱防治。但是自2013年以来，褐飞虱对噻嗪酮产生了高水平抗性，2014年国家农业技术推广服务中心建议在防治褐飞虱中暂停使用噻嗪酮。有研究表明，几丁质合成酶的突变是导致褐飞虱对噻嗪酮抗性产生的原因。干扰几丁质合成酶的表达会可以提高褐飞虱对噻嗪酮的敏感性。因此，rnai技术与噻嗪酮的联用可用于褐飞虱的防治。

5、目前的防治褐飞虱的方案存在以下问题：

6、1)农业害虫抗药性上升，化学农药防治效果变差，亟需开发新型高效的防治方法；

7、2)害虫抗药性问题需要解决；

8、3)rnai技术可用于害虫防治，但是体外递送dsrna的效率较低；

9、4)纳米材料可用于递送dsrna，但是现有载体存在合成成本高、细胞毒性大等问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种褐飞虱靶标融合基因nlchs-cht1及其具有高效致死作用的纳米共递送体系，本发明以褐飞虱几丁质合成以及降解通路上的两个关键基因—几丁质合成酶(nlchs)和几丁质酶1(nlcht1)基因为靶标，融合得到靶标融合基因nlchs-cht1，基于生物技术制备具有高致死作用的dsnlchs-cht1，进一步基于纳米载体zif-8构建dsnlchs-cht1和农药分子噻嗪酮共递送体系(buprofezin@dsnlchs-cht1@zif-8)，即为具有高效致死作用的纳米共递送体系buprofezin@dsnlchs-cht1@zif-8，该纳米共递送体系既可通过rnai与噻嗪酮联用提高杀虫效果，又可通过干扰靶标基因提高褐飞虱对噻嗪酮的敏感性，这为噻嗪酮的抗性治理提供了新的思路和视角，有助于噻嗪酮在害虫防治中的应用，同时提高了rnai技术在褐飞虱防治中的应用效果，明确了rnai与化学农药联用的应用潜能，为实现褐飞虱的高效精准防治提供了新策略。

2、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：

3、本发明提供了一种褐飞虱靶标融合基因nlchs-cht1，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明还提供了一种重组载体pesi-t-nlchs-cht1，所述重组载体含有上述褐飞虱靶标融合基因nlchs-cht1的表达载体，其中，所述表达载体为pesi-t载体。

5、本发明还提供了一种重组载体l4440-nlchs-cht1，所述重组载体含有上述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的表达载体，其中，所述表达载体为l4440。

6、本发明还提供了一种含有上述重组载体l4440-nlchs-cht1的宿主细胞，所述宿主细胞为ht115感受态细胞。

7、本发明还提供了一种利用上述宿主细胞诱导提取dsnlchs-cht1的方法，所述方法是将含有重组载体l4440-nlchs-cht1的宿主细胞培养，摇至od600＝0.40左右加入iptg，使其终浓度为1mm，进行诱导表达，37℃振荡培养4h，提取细菌总rna，纯化后得到的dsrna，即为ds nlchs-cht1。

8、本发明还提供了一种具有高效致死作用的纳米共递送体系，所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2-甲基咪唑、0.03～0.08份的噻嗪酮和0.05～0.2份的上述方法制备得到的dsnlchs-cht1。

9、进一步地，所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13.86份的2-甲基咪唑、0.06份的噻嗪酮和0.10份的dsnlchs-cht1。

10、本发明还提供了一种具有高效致死作用的纳米共递送体系的制备方法，包括以下步骤：

11、1)按重量份数比称取1份的六水合硝酸锌溶液、13～14份的2-甲基咪唑溶液、0.03～0.08份的噻嗪酮和0.05～0.2份的权利要求5所述方法制备得到的dsnlchs-cht1；

12、2)将六水合硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于0.1％triton x-100水溶液中，分别得到六水合硝酸锌triton x-100水溶液和2-甲基咪唑triton x-100水溶液；

13、3)将噻嗪酮溶液溶于二甲基亚砜dmso中，得到噻嗪酮饱和dmso溶液；

14、4)将dsnlchs-cht1加入六水合硝酸锌triton x-100水溶液，室温搅拌；得到反应溶液；然后向反应溶液中加入噻嗪酮饱和dmso溶液，室温搅拌混合均匀，最后加入2-甲基咪唑triton x-100水溶液室温反应，反应结束后，离心收集纳米颗粒，用去离子水和无水乙醇洗涤三次，真空干燥；最终得到具有高效致死作用的纳米共递送体系buprofezin@dsnlchs-cht1@zif-8。

15、进一步地，所述步骤4)中，离心转速为10000rpm。

16、本发明还提供了一种上述的纳米共递送体系在防治褐飞虱中的应用。

17、本发明的有益效果：

18、(1)本发明利用ht115-l4440体系诱导表达得到dsrna，大大降低了dsrna的合成成本；

19、(2)本发明利用zif-8纳米材料递送dsrna，提高了褐飞虱靶基因沉默效率；

20、(3)本发明构建了杀虫剂与dsrna共同负载体系，利用zif-8同时负载了dsrna与杀虫剂，合成方法简单反应条件温和，具备实际应用的潜力；

21、(4)本发明将rnai与噻嗪酮联用既提高了杀虫效果，又可通过干扰靶标基因提高褐飞虱对噻嗪酮的敏感性，有助于噻嗪酮的抗性治理及rnai技术的应用；

22、(5)本发明更换靶标基因与杀虫剂，该体系也可以完成对其他害虫的抗药性治理。

23、综上所示：本发明纳米共递送体系既可通过rnai与噻嗪酮联用提高杀虫效果，又可通过干扰靶标基因提高褐飞虱对噻嗪酮的敏感性，这为噻嗪酮的抗性治理提供了新的思路和视角，有助于噻嗪酮在害虫防治中的应用，同时提高了rnai技术在褐飞虱防治中的应用效果，明确了rnai与化学农药联用的应用潜能，为实现褐飞虱的高效精准防治提供了新策略。