一种提高链霉菌中磷酸肽类化合物产量的方法

本发明涉及微生物发酵，尤其是涉及一种提高链霉菌中磷酸肽类化合物产量的方法。

背景技术：

1、目前大约2/3的已知抗生素来源于放线菌产生的次级代谢产物，其中大部分由链霉菌产生。随着人类对抗生素的广泛使用，出现了许多广谱耐药菌和超级细菌，严重威胁着人类的生命健康安全，在临床上造成极高的致死率(35–72％)。所以，研发新型逆转耐药的药物刻不容缓。而与普通天然产物的整体成药率(0.6％)相比，碳磷天然产物有着极高的潜在成药率(8.3％)，具有抗菌、抗寄生虫、抗病毒、除草等活性，是药物先导物开发的重要资源。在碳磷天然产物中，有一类侧链连接寡肽链的高活性碳磷天然产物，即磷酸肽类化合物。其作用机制特别，其中的寡肽链起到了“特洛伊木马”的作用，能够将磷酸肽伪装后进入细菌细胞内部，在肽酶的水解作用下释放出具有抗生素功能的碳磷活性基团，最终杀死细菌。磷酸肽类化合物中具有独特的酰胺键(–co–nh–)结构，根据文献调研，目前已被报道的磷酸肽类化合物中酰胺键的形成主要由三种酶进行催化介导，分别是atp抓取肽连接酶、氨酰基-trna(aa-trna)依赖性肽连接酶、非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptidesynthetase,nrps)。其中，atp抓取肽连接酶介导生成的磷酸肽类化合物结构侧链中含有精氨酸、丙氨酸和天冬酰胺等氨基酸，故氨基酸可能是此类化合物的前体物质之一。

2、链霉菌具有独特的遗传特点和新陈代谢特征，能够产生大量结构新颖、生物活性多样的次级代谢产物，是药物先导物生产的主要来源之一，故从链霉菌中挖掘新颖的碳磷天然产物具有重大潜力。但是，迄今为止已被挖掘的碳磷天然产物仅有60余种，碳磷天然产物的挖掘面临着诸多困境，尤其是产量低的问题，潜力碳磷天然产物菌株产生的碳磷天然产物产量甚至低至10μg/ml，这意味着为获取一定量的产物进行分离纯化需要多批次多数量进行放大发酵积累产物，时间周期长、耗费成本高、工作量大，非常不利于药物先导物的研发与生产。故研究碳磷天然产物产量提高策略非常有必要，这将极大促进新颖碳磷天然产物的发现，并为新型药物先导物的研发奠定物质基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服上述现有技术碳磷天然产物挖掘研究中存在的所需发酵时间长且产量低等缺陷而提供一种提高链霉菌streptomyces sp.ls131440中磷酸肽类化合物生物合成基因簇nc30的异源表达重组子s.albus j1074(nc30-m)发酵产物中磷酸肽类化合物产量的方法。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案为提供一种提高链霉菌中磷酸肽类化合物产量的方法，包括如下步骤：

4、s1、活化并传代链霉菌streptomyces sp.ls131440中磷酸肽类化合物生物合成基因簇nc30的s.albus j1074异源表达重组子，得到稳定生长的单克隆菌株；

5、s2、将s1步骤得到的单克隆菌株先进行种子液培养，然后转移至发酵培养基中进行放大培养，提高磷酸肽类化合物nc30-1、nc30-2、nc30-3、nc30-4、nc30-5中的任意一种或多种磷酸肽类化合物的产量；

6、其中，所述发酵培养基为添加了前体物质、诱导剂或其组合的ms液体发酵培养基，所述前体物质包括三酰甘油(triacylglycerol,tag)或氨基酸中的任意一种或其组合，所述诱导剂为氮乙酰葡糖胺(n-acetylglucosamine,glcnac)。

7、链霉菌streptomyces sp.ls131440中磷酸肽类化合物生物合成基因簇nc30的s.albus j1074异源表达重组子是由野生型菌株streptomyces sp.ls131440中的磷酸肽类化合物生物合成基因簇nc30(标记为streptomyces sp.ls131440-nc30)通过recet和redαβ重组技术实现基因簇克隆得到大肠杆菌escherichia coli dh10b(nc30-m)，再通过三亲本接合转移到链霉菌s.albus j1074中得到的异源表达重组子，标记为s.albus j1074(nc30-m)，其构建方法已于专利cn111979136a公开。

8、野生型菌株streptomyces sp.ls131440已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保藏号为cgmccno.17649，已于专利cn111979136a公开。

9、s1步骤具体为：将s.albus j1074(nc30-m)保种管从-80℃冰箱中取出，待融化后于超净台中吸取100μl菌液采用四区划线法在ms抗性平板上进行活化，于30℃恒温恒湿培养箱中倒放静置培养7d，肉眼可见白色偏黄绒毛状单克隆菌落长出，其中ms抗性平板的培养基组成为：甘露醇20g/l，黄豆饼粉20g/l，琼脂20g/l，用naoh调节ph至7.0，添加的抗性为浓度50mg/ml的阿泊拉霉素，添加比例为1‰(v/v)。挑取一个单克隆，在空白ms抗性平板上采用四区划线法进行传代，继续于30℃恒温恒湿培养箱中倒放静置培养7d。

10、s2步骤具体为：挖取3个1cm2大小的菌株单克隆琼脂块接种于种子液培养基中，并向种子液培养基中加入1‰(v/v)阿泊拉霉素，种子液培养基体积为50ml，放入250ml锥形瓶中，接种后于30℃、220rpm摇床中培养2d，此为种子液，其中种子液培养基组分为：bd difco公司商用tsb培养基30g/l。以15％(v/v)接种量，即15ml种子液接入330ml发酵液体培养基中，并向发酵液体培养基中加入1‰(v/v)阿泊拉霉素，置于30℃、220rpm摇床中培养7d。吸取100μl种子液接种于150mm发酵固体培养基平板，采用涂布方法进行接种，使用无菌涂布棒将种子液在平板上涂抹均匀，直至无明显液体，将平板倒放放置于30℃恒温恒湿培养箱静置培养7d或10d。

11、进一步地，三酰甘油的添加量与发酵培养基的体积比为1％～8％。

12、更进一步地优选，三酰甘油的添加量为2％、4％、8％。

13、进一步地，氮乙酰葡糖胺的添加量为10mm。

14、更进一步地，氮乙酰葡糖胺的添加时间为菌株生长的0h～60h。

15、更进一步地优选，氮乙酰葡糖胺的添加时间为菌株生长初期(0h)、对数生长中期(16h)、稳定期前期(24h)、稳定期中期(36h)、稳定期后期(48h)、衰亡期前期(60h)。

16、进一步地，氨基酸的种类包括精氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的组合、或者包含精氨酸、天冬酰胺和丙氨酸组合之外的其它氨基酸。

17、更进一步地，其它氨基酸选自苏氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸中的任意一种或多种。

18、更进一步地，每种氨基酸的添加量为1g/l，每种氨基酸均为l构型。

19、进一步地，当发酵培养基中添加三酰甘油时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-7；当发酵培养基中添加氮乙酰葡糖胺时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-8。

20、进一步地，所述发酵培养基还为选自添加前体物质或未添加前体物质的pep11液体培养基、pep14液体培养基、pep17液体培养基、pep28液体培养基、atcc 172液体培养基、gubc固体培养基中的任意一种，

21、所述pep11液体培养基中，各组分含量为：可溶性淀粉10g/l，磷酸氢二钾1g/l，七水合硫酸镁1g/l，氯化钠1g/l，硫酸铵2g/l，碳酸钙2g/l，七水合硫酸亚铁1mg/l，七水合硫酸锌1mg/l，二水合氯化锰1mg/l；

22、所述pep14液体培养基中，各组分含量为：乳糖30g/l，黄豆饼粉15g/l，酵母提取物2.5g/l，肉类浸膏1g/l，硫酸铵5g/l，氯化钠4g/l，碳酸钙4g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，调节ph至7.2；

23、所述pep17液体培养基中，各组分含量为：无水葡萄糖30g/l，蛋白胨5g/l，干酵母10g/l，黄豆饼粉10g/l，磷酸二氢钾2g/l，氯化钠2g/l，碳酸钙3g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸亚铁0.01g/l，氯化镍0.001g/l，氯化钴0.0001g/l；

24、所述pep28液体培养基中，各组分含量为：右旋葡萄糖1g/l，乳糖10g/l，甘油20ml/l，大豆蛋白胨5g/l，硝酸铵1.5g/l，酵母提取物1g/l，微量元素溶液0.2ml/l，调节ph至6.0；其中，在微量元素溶液中，各组分含量为：硫酸亚铁4g/l，硫酸锰5g/l，七水合硫酸锌2.5g/l，硼砂1.4g/l，六水合氯化钴0.2g/l，五水合硫酸铜0.5g/l，二水合硫酸镁0.2g/l，调节ph至7.2；

25、所述atcc 172液体培养基中，各组分含量为：右旋葡萄糖10g/l，可溶性淀粉20g/l，酵母提取物5g/l，酪蛋白水解物5g/l，碳酸钙1g/l，调节ph至7.3；

26、所述gubc固体培养基中，各组分含量为：蔗糖10g/l，牛肉提取物5g/l，酪蛋白水解物5g/l，甘油5g/l，1m磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液5ml/l，hunter’s concentrated base2ml/l，灭菌后添加使用过滤除菌后的balch’s vitamins10ml/l，琼脂粉20g/l，其中，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲的ph为7.3；在hunter’sconcentrated base中，各组分含量为：次氮基三乙酸20g/l，七水合硫酸镁59.3g/l，二水合氯化钙6.67g/l，四水合钼酸铵18.5mg/l，七水合硫酸亚铁0.198g/l，edta钠盐0.25g/l，七水合硫酸锌1.095g/l，七水合硫酸亚铁0.5g/l，一水合硫酸锰0.154g/l，五水合硫酸铜39.2mg/l，六水合硝酸钴25.0mg/l，十水硼砂17.7mg/l，调节ph至6.8；在balch’s vitamins中，各组分含量为：对氨基苯甲酸5mg/l，叶酸2mg/l，生物素2mg/l，烟酸5mg/l，泛酸钙5mg/l，核黄素5mg/l，盐酸硫胺素5mg/l，盐酸吡哆醇10mg/l，钴胺素100μg/l，硫辛酸5mg/l，调节ph至7.0。

27、更进一步地，当发酵培养基为gubc固体培养基时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-6；当发酵培养基为添加了三酰甘油的pep14液体培养基时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-7；当发酵培养基为添加了氨基酸的pep17液体培养基时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-9；当发酵培养基为添加了氨基酸、三酰甘油、氮乙酰葡糖胺的pep17液体培养基时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-9；当发酵培养基为添加了氨基酸和三酰甘油的pep17液体培养基时，s.albus j1074异源表达重组子(s.albus j1074(nc30-m))还产生碳磷化合物nc30-10或nc30-9中的任意一种或多种。

28、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

29、(1)本发明通过筛选适合s.albus j1074(nc30-m)菌株生长和产生次级代谢产物的培养基、添加前体物质或诱导剂的时间及含量，大幅度提高其产生的磷酸肽类化合物产量，使得重组子s.albus j1074(nc30-m)产生的磷酸肽类化合物nc30-1最高提高了7.9倍，nc30-2最高提高了5.6倍，nc30-3最高提高了51.5倍，nc30-4最高提高了16.0倍，nc30-5最高提高了6.4倍。

30、(2)本发明还激活s.albus j1074(nc30-m)菌株中nc30基因簇产生5个新的碳磷化合物，分别为nc30-6、nc30-7、nc30-8、nc30-9、nc30-10。

31、(3)本发明通过在培养基中添加三酰甘油，有效减少了氧磷化合物杂质的干扰，减小后续分离纯化的难度，整个过程操作简单，工艺成熟，成本低廉，无毒无害，对环境非常友好。

32、(4)本发明提出的磷酸肽类化合物产量提高方法以及其实验探索过程为后续研究磷酸肽类化合物和碳磷化合物的产量提高提供了新的思路和策略，化合物产量的提高使得获取该类化合物更加简单容易，推动了该类化合物的进一步发现和研究，为后续丰富该类化合物文库以及发现新型药物先导物奠定了坚实的基础。