本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌活菌的快速准确定量方法。
背景技术：
：：1、食品微生物污染是影响食品安全的重要问题，其中蜡样芽孢杆菌是主要的食源性致病菌之一。蜡样芽孢杆菌广泛存在于人类生存环境中，会污染食品导致食品腐败变质，还会附着于动植物或其加工器械上而进入食物链中，其食源性感染会导致两种类型的中毒，分别为呕吐型和腹泻型，也有致死风险。非食源性感染会引起眼疾、心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。蜡样芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌菌群中的其他成员具有极高的dna同源性，十分难以区分，且蜡样芽孢杆菌引起的食源性中毒与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或产气荚膜杆菌等引起的食物中毒类似，很容易误诊。这些原因严重影响了蜡样芽孢杆菌的暴露剂量评估与临床诊断。2、目前，蜡样芽孢杆菌的检测方法主要参考《gb 4789.14-2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》中的平板计数法检测，但是该方法需培养24-48h后计数得到结果，还需要结合生化鉴定、动力试验等多个步骤进行确证，耗时长、过程繁琐，难以满足实际需求。因此，有必要建立一种快速灵敏的活菌定量检测方法来实现对食品中蜡样芽孢杆菌的活菌监测。3、目前常见的蜡样芽孢杆菌快速检测方法包括基于pcr的分子生物学方法、基于抗体特异性的免疫学方法等(hall a,et al.profiling bacillus cereus populations ina traditional style,hot-drinks vending machine and vended hot chocolate drinkusing polymerase chain reaction(pcr)and random amplified polymorphic dna(rapd)techniques.food control,2012.27(1):127-131.；soleimanim,etal.prevalence,molecular identification and characterization of bacilluscereus isolated from beef burgers.journal of food safety,2017.38(1):e12414.；zhu l,et al.development of adouble-antibody sandwich elisa for rapiddetection of bacillus cereus in food.scientific reports,2016.6:16092.；wei s,et al.dynabeads protein g antibody conjugates combined with modified brainheart infusion broth for the enrichment and separation of bacillus cereus inartificially contaminated vegetables.food science and biotechnology,2016.25(3):941-947.)。然而，核酸扩增存在天然偏好性，其扩增效率难以保持一致，对目标基因的检测也导致无法直接定量菌株，更需要专业人员进行操作，难以满足快速、直观定量活菌的检测要求；抗体制备复杂、成本较高，能够有效、特异性地靶向蜡样芽孢杆菌的抗体相对缺乏，且由于蜡样芽孢杆菌与菌群中的其他成员亲缘关系密切，蜡样芽孢杆菌的抗体易与枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等发生交叉反应，且重现性和稳定性相对较低。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)根据核酸探针与靶向dna序列同源互补的原理，在杂交缓冲液作用下形成杂交体，通过检测核酸探针偶联的荧光基团即可标记目标菌，具有极高的特异性。然而，常规fish结果通过显微镜检测，这要求操作人员需要高水平的专业知识，数据分析费时费力，不确定度较大，无法快速、准确的对蜡样芽孢杆菌活菌进行定量分析，也难以区分细胞死活。为克服上述问题，流式分析法越来越广泛地应用于细菌测量与分析；通过高效标记活死细菌，即可区分样品中的活死菌；通过探针特异性标记蜡样芽孢杆菌，即可利用流式细胞仪准确快速地计数样品中活的蜡样芽孢杆菌。目前常用的活死菌标记多以膜完整性、胞内酶活性和膜电势为靶标，通过选取对应的荧光染料，实现样品中的活菌标记与流式分析。但是，膜完整性、胞内酶活性和膜电势差等参数是否准确代表细菌的真实活性是未知的，例如，紫外消毒后，细菌虽然死亡，但膜结构仍然完整；部分细菌死亡后，短时间内仍存在胞内酶活性及膜电势等。此外，由于不同样品或条件下细菌活性不同，以及有活性但不可培养(vbnc)状态的细菌存在，流式分析法与平板计数法得到的活菌总数结果并非完全一致，并且两者的换算关系是未知的。因此，为实现样品中蜡样芽孢杆菌活菌的快速准确测量，亟需发掘准确表征活菌的细胞活性参数及对应染料，并探索特异性标记蜡样芽孢杆菌的探针，建立可靠的流式分析结果与平板计数结果间的数学模型。技术实现思路1、为此，本发明提供一种蜡样芽孢杆菌活菌的快速准确定量方法，以解决现有检测方法耗时长、不能特异性检测蜡样芽孢杆菌、不能准确定量蜡样芽孢杆菌活菌等问题。2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：3、根据本发明提供的一种蜡样芽孢杆菌活菌的快速准确定量方法，包括：4、步骤一，使用第一处理液与第二处理液完成食品样品预处理，得预处理样品；5、步骤二，使用可以标记死菌核酸的红色染料对样品进行第一荧光标记，区分样品中的死菌与其他颗粒并抑制死菌的第二荧光标记；其中，第一荧光标记死菌核酸，第二荧光标记蜡样芽孢杆菌的核酸，二者有竞争，所以蜡样芽孢杆菌死菌被标记第一荧光后就难以标记第二荧光6、步骤三，使用荧光基团交联的蜡样芽孢杆菌特异性核酸探针对样品进行第二荧光标记，区分样品中蜡样芽孢杆菌活菌与其他颗粒；7、步骤四，使用高分辨率流式细胞仪对标记样品中颗粒的荧光信号进行检测；8、步骤五，统计所述样品中第二荧光标记颗粒数，以此计算出蜡样芽孢杆菌活菌数；9、其中，第一处理液包含可去除食品样品中脂质颗粒的温和去垢剂；第二处理液包含可消化食品样品中蛋白颗粒的蛋白酶混合物。10、进一步的，所述步骤二中，通过开展蜡样芽孢杆菌代表菌株在食品加工过程中典型的加热胁迫条件下的活性表征研究，筛选得到可准确表征代表物种活性的死菌特异性染料。11、进一步的，所述步骤二中，核酸染料为能标记死菌并与其核酸稳定结合的红色荧光染料；12、进一步的，所述步骤三中交联荧光基团的核酸探针为与蜡样芽孢杆菌保守序列互补的特异性探针，序列长度为8-400个碱基。该探针特异性进入蜡样芽孢杆菌内部，与核酸结合发出荧光信号。13、进一步的，所述红色荧光核酸染料为pma，ema，pi，eb中的一种或几种。14、进一步的，所述蜡样芽孢杆菌特异性核酸探针交联的荧光基团选自alexa fluor488，fitc，fam，pe，cy3，atto 425中的一种或几种。15、进一步的，所述步骤三中，第一荧光标记条件为红色荧光核酸染料浓度1-200μm，室温避光孵育5-60min；16、和/或，第二荧光标记条件为荧光基团交联的蜡样芽孢杆菌特异性探针浓度0.1-50μm，避光孵育1-120min。17、进一步的，所述步骤四中，高分辨率流式细胞仪光学分辨率为30-100nm，所述高分辨率流式细胞仪通过透镜系统将收集到的光信号进行光电转换，分别拾取样品中各个细菌发射的光电信号；检测电压为300-500v，进样体积为10-1000μl，分析时间为10-100s。18、进一步的，所述高分辨率流式细胞仪中，第一荧光标记波长为590-690nm，红色荧光；第二荧光标记波长为480-589nm(非红色荧光)。19、进一步的，所述步骤五中，数学模型为：20、21、其中，n为推导计算的平板计数法结果(cfu/ml)，k为稀释因子，m为第二荧光表征的蜡样芽孢杆菌活菌数目(cells/μl)，3为换算系数。22、进一步的，所述步骤五中，第二荧光标记蜡样芽孢杆菌活菌与平板计数法结果为线性关系，相关系数r2大于0.99。23、本发明具有如下优点：24、(1)本发明的蜡样芽孢杆菌活菌的快检方法具有预处理方法简单、检测灵敏度高的特征；25、(2)本发明的蜡样芽孢杆菌活菌的快检方法可以对蜡样芽孢杆菌活性进行准确的表达与定量检测；具有细菌活性表征准确、测量时间短的特征，可在1.5小时内完成全部检测；本发明的蜡样芽孢杆菌活菌的快检方法可通过建立的数学模型，将流式分析结果准确可靠转换至平板计数法结果，方便与现有标准比较，显著提升蜡样芽孢杆菌活菌检测的效率。当前第1页12当前第1页12