一种由燕麦镰孢菌制备恩镰孢菌素的方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种由燕麦镰孢菌制备恩镰孢菌素的方法。

背景技术：

1、恩镰孢菌素是镰刀菌属产生的一类六脂肽类真菌毒素，迄今为止，已经鉴定了29种天然存在的恩镰孢菌素类似物，但在谷类中仅发现了7种(恩镰孢菌素a、a1、b、b1、b2、b3和b4)，其中前4种，即恩镰孢菌素a、恩镰孢菌素a1、恩镰孢菌素b、恩镰孢菌素b1，在食品和饲料中最常见，近年来经常在农作物中被检出。欧洲食品安全局于2014年发布了一份风险评估报告，其中指出谷物及其制品是人类膳食暴露该毒素的重要途经。

2、恩镰孢菌素能引起农作物的萎蔫和坏死，对人体上皮细胞、免疫细胞、卵巢细胞等也具有很强的毒性作用，如免疫毒性、血液和骨髓毒素。此外还具有抗菌、体外降血脂及可作为离子载体的作用。镰刀菌属产生的其他真菌毒素如玉米赤霉烯酮及伏马毒素等已有相当程度的研究，然而对于近年来常检出的恩镰孢菌素则研究较少，国内对此尚无国标明确规定其在食品中的具体限量。鉴于恩镰孢菌素的危害极大，开发恩镰孢菌素的制备及分离纯化技术将有助于后续开展农产品中量值核查等研究分析。

3、恩镰孢菌素b是已发现的多种恩镰孢菌素类似物中的一种。分子式为c33h57n3o9，其相对分子质量为639.820da。有文献指出，在多种恩镰孢菌素类似物中，尤其以恩镰孢菌素b的污染情况最为严重。

4、目前的恩镰孢菌素类化合物的制备方法是基于固体发酵(专利(cn102787148a)，存在发酵物产生的固体废弃物对环境造成污染的问题；且使用发酵罐发酵，所需设备昂贵，成本较高；此外，现有技术固体提取不充分，提取产物困难、恩镰孢菌素产率低、纯度低等问题。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种由燕麦镰孢菌制备恩镰孢菌素的方法，采用环境友好、成本低、工艺操作简便和适合工业化生产的液体发酵的方式以避免固体废弃污染物的产生，同时提高恩镰孢菌素的产率。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种由燕麦镰孢菌制备恩镰孢菌素的方法，其特征在于，其包括：培养燕麦镰孢菌，通过液体发酵的方式获得发酵产物，将所述发酵产物进行恩镰孢菌素的粗提，获得粗品；然后将粗品过硅胶层析柱纯化；再将层析纯化后的产物上ods柱进行纯化，然后将ods柱层析纯化后的产物上c18依利特色谱柱进行纯化，收集出峰时间为16-25min时的产物。

4、燕麦镰孢菌(fusarium avenaceum)其购买自商城北纳创联生物科技有限公司，菌株编号bncc143004。

5、发明人发现该菌株比现有的镰孢菌具有恩镰孢菌素产率高、繁殖周期短、易分离恩镰孢菌素类化合物的优势，尤其是恩镰孢菌素b的产率保持在较高水平。

6、现有技术采用蛋白胨、大豆等作为固体发酵培养基，接种于发酵罐发酵5-10天。每公斤培养基可产出2g的培养产物，发酵物产生固体废弃物，对环境有污染；所需设备昂贵，成本较高；固体提取不充分，提取产物困难。

7、而本发明提供的液体发酵的方式不产生固体废料，对废液处理更为简便。与固体发酵相比，发酵液中恩镰孢菌素分散均匀，更易提取，产率高，制备时间短，产物杂质少，易分离纯化。具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。

8、本发明提供的制备方法制得的恩镰孢菌素纯度高。

9、在本发明应用较佳的实施方式中，粗提是采用有机溶剂提取；

10、在一种可选的实施方式中，有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳或甲醇；

11、在一种可选的实施方式中，粗提包括：将发酵产物与二氯甲烷混合，搅拌，然后进行超声处理；分层后，取下层有机相进行有机溶剂的去除，获得粗品；

12、在一种可选的实施方式中，搅拌的时间为10-40min；超声处理的条件为40-50hz处理10-40min；有机溶剂的去除为旋转蒸发或恒温干燥。

13、在本发明应用较佳的实施方式中，硅胶层析柱层析时包括：先将粗品用体积百分比为15％-20％的甲醇与80％-85％的二氯甲烷的混合溶剂进行溶解，与硅胶混匀后，浓缩，然后浓缩至干的样品上硅胶层析柱纯化，采用体积百分比为3％-5％的甲醇与95％-97％的二氯甲烷的混合溶剂洗脱。选择二氯甲烷/甲醇作为复溶液，再浓缩成油状物有利于后续的色谱纯化获得更高纯度和收率的目标产物。

14、在本发明应用较佳的实施方式中，ods柱的纯化步骤包括：将硅胶层析柱纯化后的产物用二甲基甲酰胺(dmf)进行复溶，然后上ods柱进行纯化；采用甲醇水溶液进行洗脱。dmf是一种反向制备复溶剂，可以溶解水溶性不好的物质。

15、在一种可选的实施方式中，采用甲醇水溶液进行洗脱后，将洗脱产物进行浓缩，再用体积百分比为15％-20％的甲醇与80％-85％的二甲基甲酰胺的混合溶剂进行复溶浓缩用于c18依利特色谱柱纯化；甲醇水溶液为85％-90％的甲醇水溶液。复溶的作用在于：选择合适的纯化时的进样浓度，在获得较高纯度的恩镰孢菌素b的同时尽可能提高纯化效率。

16、在本发明应用较佳的实施方式中，c18依利特色谱柱纯化所采用的色谱柱为11号依利特制备柱，色谱采用的流动相为水和乙腈，以30 -35ml/min的流速进行梯度洗脱，柱温为25-40℃；洗脱程序如下：

17、0-30min流动相中水溶液的体积百分比为20％，流动相中乙腈的体积百分比为80％；

18、30-35min流动相中水溶液的体积百分比从20％降至0％，流动相中乙腈的体积百分比从80％升至100％；

19、35-45min流动相中水溶液的体积百分比为0％，流动相中乙腈的体积百分比为100％。

20、发明人发现在c18依利特色谱柱纯化时，流动相选择水溶液和乙腈，并采用梯度洗脱的方式能够使得几种恩镰孢菌素获得较好的分离度，包括恩镰孢菌素b、恩镰孢菌素b1和恩镰孢菌素a1，这3种恩镰孢菌素化合物均出峰时间稳定。

21、流动相之一选择乙腈，有助于恩镰孢菌素b更好的溶解于乙腈中。在上述体积百分数的流动相条件下，有助于提升洗脱的分离度。

22、在本发明应用较佳的实施方式中，收集19-21min内的洗脱液；在上述时间范围内收集的洗脱液，含高纯度的恩镰孢菌素b。

23、在一种可选的实施方式中，将19-21min内的洗脱液进行冷冻干燥，获得恩镰孢菌素b。例如收集19.5-21min内的洗脱液，或收集19-20min内的洗脱液。

24、经低温冷冻干燥，获得白色粉末，经h谱核磁谱图定性为恩镰孢菌素b，色谱纯度大于99.7％。

25、在本发明应用较佳的实施方式中，液体发酵前包括种子液的制备，其包括：将活化后的燕麦镰孢菌接种至种子液中进行培养，然后取孢子悬液接种于液体生产培养基中进行培养。

26、活化时采用的培养基为如下配方时更有利于菌种的活化培养：

27、土豆200g、葡萄糖20g、琼脂18g。土豆去皮，切小块，水煮沸后保藏30min，过滤，滤液加入20g葡萄糖、18g琼脂，蒸馏水定容至1000ml，溶解后分装灭菌，倒制pda平板。

28、在一种可选的实施方式中，活化培养基也可采用3g硝酸钠，1g磷酸氢二钾，0.5g硫酸镁(mgso4·7h2o)，0.5g氯化钾，0.01g硫酸亚铁，30g蔗糖，20g琼脂，1000ml蒸馏水，加热溶解，分装后灭菌。

29、在一种可选的实施方式中，在液体生产培养基中进行静置培养9-15天。例如静置培养9天，10天，11天，12天，13天，14天或15天。采用了静置培养方式，无需大型搅拌设备等装置，具有生产成本低，装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。

30、在本发明应用较佳的实施方式中，液体培养基的ph为6.0-7.0，液体培养基包括如下原料：

31、每1l水中含：蛋白胨10g,七水硫酸镁0.5，氯化钾0.5g，七水硫酸亚铁10mg,微量元素混合液200μl，葡萄糖30g，以及微量元素；每1l水中的微量元素包括：七水硫酸锌4.5-5.5g，五水硫酸铜0.2-0.3g，一水硫酸锰40-60mg，硼酸40-60mg，二水钼酸钠40-60mg。

32、发明人发现种子液的培养基在如下配方时，更有利于种子接种：配制为羧甲基纤维素钠10g，硝酸钠1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，蛋白胨1g，蒸馏水1000ml。分装40ml/瓶。

33、在一种可选的实施方式中，种子液培养基也可采用土豆200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。土豆去皮，切小块，水煮沸后保藏30min，过滤，滤液加入20g葡萄糖，蒸馏水定容至1000ml，溶解后分装灭菌。

34、第二方面，本发明还提供了一种由上述方法制备的恩镰孢菌素。

35、在一种可选的实施方式中，恩镰孢菌素选自恩镰孢菌素b。

36、第三方面，本发明还提供了上述的方法制备的恩镰孢菌素或上述的恩镰孢菌素在如下任一项中的应用：

37、(1)制备抑菌剂；

38、(2)防治病原菌；

39、(3)防治野燕麦；

40、(4)制备离子载体；

41、(5)制备高血脂治疗剂或预防高血脂的药剂；

42、(6)制备高胆固醇血症或动脉硬化药物中的应用。

43、需要说明的是，上述(1)菌剂包括不限于液体制剂、固态菌剂、膏状菌剂、悬浮剂、乳液、喷雾剂或半固态菌剂。

44、上述菌剂的制备方法包括不限于：将上述的燕麦镰孢菌接种于真菌培养基中，在25℃～28℃下培养。

45、上述应用(4)，离子载体是一种能将离子运输跨过细胞膜脂质双层的脂溶性分子，例如选自钙离子载体。

46、上述应用(5)，制备高血脂治疗剂，包括不限于将恩镰孢菌素作为一种酰基辅酶a-胆固醇酰基转移酶(acyl-coa:cholesterol acyltransferase,acat)抑制剂，治疗高血脂症。恩镰孢菌素选自恩镰孢菌素b。

47、上述应用(6)，动脉硬化例如是动脉粥样硬化或冠状动脉硬化。

48、在一种可选的实施方式中，病原菌选自植物细菌、植物真菌或植物土传病原菌。

49、本发明具有以下有益效果：

50、本发明提供了一种恩镰孢菌素的制备方法，燕麦镰孢菌，具有恩镰孢菌素产率高、繁殖周期短、易分离恩镰孢菌素类化合物的优势，尤其是恩镰孢菌素b的产率保持在较高水平。

51、采用液体发酵的方式，不产生固体废料，对废液处理更为简便。与固体发酵相比，发酵液中恩镰孢菌素分散均匀，更易提取，产率高，制备时间短，产物杂质少，易分离纯化。具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。此外，本发明提供的方法制得的恩镰孢菌素纯度高。

52、与现有的发酵方法相比，本发明提供的恩镰孢菌素的制备方法，无需采用较昂贵的发酵罐发酵，获得的提取产物可以经浓缩复溶后直接采用制备色谱分离纯化，可实现较高纯度的恩镰孢菌素(尤其是恩镰孢菌素b1)的制备。极大程度上简化了高纯度恩镰孢菌素(尤其是恩镰孢菌素b1)的制备及分离纯化工艺，更适合于工艺化生产。