融合双链DNA结合蛋白Sto7dm的TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用

本发明属于生物技术领，具体涉及一种融合双链dna结合蛋白sto7dm的taq dna聚合酶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、taqman探针法qpcr是在传统pcr的基础上加入taqman荧光探针进行荧光检测的方法，taqman荧光探针两端分别标记有一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团，探针完整时不产生荧光。当探针与模板结合，通过taq dna聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针酶切，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而产生荧光。因此，通过检测pcr反应体系中的荧光信号强度可以实时监测整个pcr扩增过程，最后利用标准曲线对未知模板实现定量分析。这种检测方法特异性强、灵敏度高、易重复，目前已广泛应用于生物科学研究、环境监测、食品安全检测、临床诊断等领域。

2、尽管探针法qpcr技术被认为是众多核酸检测领域的“金标准”，但其检测流程繁琐、耗时长，限制了其在快速诊断应用场景的灵活性，且在核酸提取过程中容易出现样本间核酸交叉污染和核酸损失等问题。

3、针对传统qpcr技术的耗时和实验室依赖型等局限，研究学者就qpcr技术的检测仪器、检测方法、反应体系等方面作出大量研究。比如现有的全自动分子诊断检测系统，该系统集样本处理、核酸提取、qpcr扩增、检测为一体，可在45min内得到检测结果，但是目前这个系统仍然存在成本高的问题，主要用在一些特殊的项目上。国内学者开发的基于微流控芯片技术的超快pcr系统在同样能满足快速检测的需求，其中微流体的小型化设计具备更快的热导率，可在40min内完成检测，而且可兼容多个荧光通道同时检测，大大提高了检测通量，但是超快pcr模式会损失一定的检测敏感性且对dna的延伸性能有要求。不依赖超快pcr仪器或全自动技术，采用省略核酸提取过程的直扩qpcr方法同样备受关注，这种方法不仅节省了核酸提取成本，缩短了样本结果检出时间，而且避免了在核酸提取过程中出现的核酸损失或降解等问题。然而，直扩qpcr所使用的粗样本中存在pcr抑制剂，这些抑制剂会严重影响dna聚合酶的活性，从而影响检测结果。通常来说，理想的直扩体系包括酶、缓冲液、mg2+、dntps、增强剂、稳定剂等诸多因素。其中改善直扩qpcr的关键是使用具有高耐抑制剂性能的dna聚合酶。

4、综上所述，传统qpcr技术固有的一些缺点，比如检测流程的繁琐或对于复杂样本中某些抑制成分的高灵敏度，限制了qpcr技术进一步的发展，开发更加强大的qpcr检测平台是克服这些问题的一种可能的解决方案。因此，无论是结合微流控技术的超快pcr还是直扩方法的提出，都推动了taqman探针法qpcr技术朝着快速、准确、高通量、低成本的方向发展。而dna聚合酶作为qpcr技术的核心组分，其性能优劣直接影响qpcr技术的进一步发展。

5、taq dna聚合酶作为taqman探针法qpcr技术的指定用酶，具有良好的热稳定性及探针切割活性，但是野生型taq dna聚合酶存在一些缺点，比如抑制剂耐受性差，如植物核酸样本中的多糖、血液核酸样本中的免疫球蛋白、土壤核酸样本中的腐殖酸等抑制剂都会抑制taq dna聚合酶活性。另外，野生型taq dna聚合酶在最适温度时的延伸速率为1kb/min，缩短延伸时间会对其扩增效率产生负面影响。2004年，wang等人将双链dna结合蛋白sso7d融合在全长taq酶和stoffel片段的n端，显著提高了聚合酶的延伸性能和盐离子耐受性。wang等人认为双链dna结合蛋白对dna亲和力的大小会影响dna聚合酶的催化活性。dna亲和力过高，可能会对聚合酶的催化活性有负面影响；dna亲和力过低，又可能不会显着增强聚合酶的持续性。因此，需要进一步的研究来确定双链dna结合蛋白的最佳性能范围，以实现持续性和催化性之间的最终平衡。但是，wang等人并没有研究s-taq改造体在taqman探针法qpcr体系中的性能及应用，sso7d与taq酶的融合位置也只研究了n端，缺少对其他融合位置的对比研究。

6、综上所述，研究开发一种用于快速或直扩taqman探针法qpcr的高性能taq dna聚合酶，对于taqman探针法qpcr技术的发展具有重要意义。

技术实现思路

1、为克服野生型taq dna聚合酶的延伸性能不足和抑制剂耐受性差的问题，同时保证野生型taq dna聚合酶正常发挥5'-3'外切酶活性，本发明的首要目的在于提供一种融合双链dna结合蛋白sto7dm的taq dna聚合酶。该taq dna聚合酶兼具高ph稳定性、快速延伸速度、耐抑制剂能力和核酸结合能力，有利于提高taqman探针法qpcr技术的检测速度，同时适用于对免提取样本的直接扩增检测。

2、本发明的另一目的在于提供上述融合双链dna结合蛋白sto7dm的taq dna聚合酶的应用。

3、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供了一种融合双链dna结合蛋白sto7dm的taq dna聚合酶，命名为taq-sto，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、所述的双链dna结合蛋白sto7dm是将来源于超嗜热古菌sulfolobus tokodaiistrains 7的双链dna结合蛋白sto7d的非保守区域进行突变和/或插入而获得的蛋白质。所述的突变和/或插入位点包括将双链dna结合蛋白sto7d的第2位缬氨酸突变为丙氨酸、第37位天冬酰胺和第38位甘氨酸之间插入一个甘氨酸、第62位甘氨酸突变为谷氨酰胺。

6、所述的双链dna结合蛋白sto7dm连接于野生型taq dna聚合酶的c端，增加了融合蛋白的核酸结合能力，显著提高了融合蛋白的扩增速度和耐抑制剂性能。

7、所述的双链dna结合蛋白sto7dm与野生型taq dna聚合酶通过连接子“sgtgggg”连接，可以促进重组蛋白的充分折叠并发挥活性。

8、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子包括编码第一方面所述的taq-sto的dna片段。

9、所述的dna片段的核苷酸序列如seq id no:2所示，能够在大肠杆菌表达系统中进行异源表达。

10、第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体包括第二方面所述的核酸分子。

11、第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括第三方面所述的表达载体；

12、第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的taq-sto的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

13、s1、将第三方面所述的表达载体转化到感受态细胞中，冰浴后热休克，在冰上冷却复苏，加入lb液体培养基进行恒温振荡培养，挑取单克隆细胞进行筛选；

14、s2、提取筛选的阳性克隆的表达载体，转化到宿主细胞，并将宿主细胞接种于lb液体培养基，进行恒温振荡培养，获得含有taq-sto的种子培养液；

15、s3、取所述的种子培养液接种于lb液体培养基中，进行放大培养，获得含有taq-sto的菌液；

16、s4、向所述的菌液中加入iptg诱导宿主细胞表达taq-sto，离心，获得含有taq-sto的菌体沉淀；

17、s5、向所述的菌体沉淀中加入裂解缓冲液，重悬含有taq-sto的菌体，通过超声破碎所述菌体，离心，获得含有taq-sto的破碎菌体上清液；

18、s6、将所述的破碎菌体上清液通过恒温孵育、离心去除杂质蛋白，获得含有taq-sto的蛋白上清液；

19、s7、将所述的蛋白上清液进行镍离子亲和层析，利用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，形成层析洗脱液，取所述层析洗脱液进行蛋白变性，利用sds-page电泳方法检测所述层析洗脱液，收集含有taq-sto的层析洗脱液，即获得所述的taq-sto。

20、第六方面，本发明提供了一种taqman探针法qpcr反应试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的taq-sto。

21、优选地，所述试剂盒还包含taq dna聚合酶的抗体。

22、所述的taq dna聚合酶的抗体与taq-sto结合后能够在75℃以下抑制聚合酶的活性，可以有效低抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。

23、优选地，所述试剂盒还包含灭菌超纯水、引物对、taqman探针、dntps、或qpcr反应缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

24、优选地，所述的qpcr反应缓冲液的组成包括：20～60mmol/l tris-hcl、10～50mmol/lkcl、5～10mmol/l(nh4)2so4、4～6mmol/l mgcl2、0.05％～0.1％ tween-20，ph8～10。

25、优选地，所述qpcr反应缓冲液的组成还包括一种或多种pcr增强剂，所述的pcr增强剂包括但不限于5％～20％(v/v)的甘油、100～500mmol/l甜菜碱、0.2～1.0mmol/l亚精胺和0.2～1.5g/l bsa。

26、第七方面，本发明提供了第六方面所述的taqman探针法qpcr反应试剂盒在快速taqman探针法qpcr扩增中的应用；

27、优选地，所述的快速taqman探针法qpcr扩增的反应程序设置为95℃预变性30s，95℃加热10s，53℃退火延伸30s，共45个循环；或95℃预变性30s，95℃加热10s，53℃退火延伸1s，共45个循环。

28、第八方面，本发明提供了第六方面所述的taqman探针法qpcr反应试剂盒在含有dna病毒的复杂样本中的直扩应用。

29、优选地，所述的含有dna病毒的复杂样本包括但不限于含有非洲猪瘟病毒基因组dna的组织、猪肉或粪便样本。

30、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

31、本发明通过在野生型taq dna聚合酶的c端融合双链dna结合蛋白sto7dm，得到的taq-sto，具有高ph稳定性、高抑制剂耐受能力和增强的扩增速度。在ph 3～10之间能保持80％以上的酶活，ph稳定性显著提升；pcr延伸速率可达到1kb/s，延伸性能提升12倍；对常见抑制剂具有较高的耐受性，至少可耐受1.0μg/μl腐殖酸、0.5ng/μl单宁酸、1.0％(v/v)全血。

32、本发明的基于taq-sto的所述taqman探针法qpcr反应试剂盒检测速度快、灵敏度高、耐抑制剂性能好，不仅可以用于超快速qpcr检测，且可以省略核酸提取步骤直接以复杂样本为模板，节约实验和时间成本，在核酸快检领域具有良好的应用前景和巨大的市场价值。