一种塑料降解酶及其镜像对映体、化学合成方法

本发明涉及酶工程，尤其涉及一种塑料降解酶及其镜像对映体、化学合成方法。

背景技术：

1、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)是最丰富的聚酯塑料，因其难以降解，可以长久的存在于自然环境中，给环境带来了极大的污染。同时，最新研究发现，塑料使用过程中会产生大量直径小于5毫米的微塑料，这些微塑料已经被发现在人类结肠、血液，甚至胎盘等组织中存在，并可能对人类各个器官造成危害。利用塑料降解酶(petase这类专门降解pet塑料的蛋白酶，可以将pet塑料降解为对环境无害的乙二醇(eg)和对苯二甲酸(tpa)，塑料降解酶的广泛应用是解决pet塑料带来的环境污染和人体健康问题的重要手段，具有很大的商业应用价值。

2、塑料降解酶有两种结构类型：l型和d型(又称镜像版本)，其中l型塑料降解酶自身容易被环境中的微生物降解，生物稳定性低，其解聚塑料的效率在实际应用中受到影响。此外，通过生物表达制备得到的l型塑料降解酶无法进行人工修饰，使得l型塑料降解酶的生物活性的提高受到了限制。而d型塑料降解酶需要通过体外蛋白质化学合成来获取。但是，关于d型塑料降解酶的化学合成报道较少，合成效率较低。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种塑料降解酶及其镜像对映体、化学合成方法。所述合成方法通过固相合成、转硫酯化和偶联反应制备塑料降解酶，制备方法简单高效，制备得到的塑料降解酶及其镜像塑料降解酶纯度高、性能优良。

2、为达到以上目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种塑料降解酶，具有seq id no8所示的氨基酸序列。

4、优选的，所述塑料降解酶通过化学合成制备得到。所述化学合成包括固相合成和转硫酯化以及自然化学连接反应。

5、优选的，所述塑料降解酶的类型包括l型或d型。

6、本发明还提供了上述的塑料降解酶的制备方法，为通过分段偶联制备塑料降解酶；

7、所述分段包括：iccg1具有seq id no1所示的氨基酸序列；

8、iccg2具有seq id no2所示的氨基酸序列；

9、iccg3具有seq id no3所示的氨基酸序列；

10、iccg4具有seq id no4所示的氨基酸序列；

11、iccg5具有seq id no5所示的氨基酸序列；

12、iccg6具有seq id no6所示的氨基酸序列；

13、iccg7具有seq id no7所示的氨基酸序列。

14、优选的，所述氨基酸序列的类型包括l型或d型。

15、本发明所述塑料降解酶的化学合成方法，包括如下步骤：

16、步骤1：对塑料降解酶蛋白序列进行序列划分，连接位点氨基酸依次进行突变和保护；

17、步骤2：对步骤1中划分的蛋白序列进行固相合成，得到七个c末端酰肼肽；

18、步骤3：对部分c末端酰肼肽片段转硫酯；

19、步骤4：通过分段偶联的方法进行多肽片段自然化学连接，脱除保护基；

20、步骤5：通过色谱分析纯化，冻干得到塑料降解酶固体粉末。

21、上述合成方法优选采用收敛式合成，便于产物的分离纯化。

22、在本发明中，部分c末端酰肼肽先转换为硫酯肽，再与未转硫酯化肽段中的n端半胱氨酸反应进行自然化学连接，并脱除保护基，制备得到所述塑料降解酶。

23、上述制备方法首先对原塑料降解酶的氨基酸序列进行设计划分，使得连接位点的氨基酸具有突变灵活性。

24、对所述连接位点氨基酸进行突变和保护，并可经过简单处理变为原位点氨基酸。

25、所述连接位点氨基酸优选为半胱氨酸或甘氨酸。

26、所述连接位点氨基酸的保护基优选采用fmoc、thz、acm、aux中的一种或多种。

27、上述制备方法将塑料氨基酸酶序列划分为7片段，连接位点的氨基酸突变和保护为：第40位甘氨酸突变为甘氨酸辅基，无保护；第69位丙氨酸突变为半胱氨酸，fmoc基团保护；第104位丙氨酸突变为半胱氨酸，fmoc基团保护；第150位丙氨酸突变为半胱氨酸，无保护；第204位半胱氨酸，acm基团保护。

28、然后，分别合成肽段iccg1～iccg7。

29、本发明优选的，所述iccg1～iccg7由固相合成制备得到。

30、优选的，所述固相合成的树脂选自2-cl(trt)-肼树脂或rinkamide-am树脂。

31、在本发明的一些具体实施例中，所述肽段iccg1～iccg6优选采用2-cl(trt)-肼树脂，所述肽段iccg7优选采用rink amide-am树脂。

32、上述肽段iccg1～iccg7优选使用自动微波多肽合成仪合成或手动合成。

33、所述自动微波多肽合成仪合成的时间优选为5～12h。

34、所述手动合成的时间优选为1～2周。

35、本发明合成肽段iccg6后，需要引入助溶基团增加片段溶解度。

36、所述助溶基团优选采用hbm基团。在本发明的一些具体实施例中在塑料降解酶的第216位氨基酸上引入hbm助溶基团。

37、最后，将肽段iccg1～iccg7通过分段偶联的方法制备得到所述的塑料降解酶。

38、本发明优选的，所述分段偶联包括：

39、1)将iccg1、iccg3、iccg4、iccg6分别进行氧化得到硫酯肽；

40、2)将所述iccg1硫酯肽与iccg2偶联得到第一产物、iccg4硫酯肽与iccg5偶联得到第二产物、iccg6硫酯肽与iccg7偶联得到第五产物；

41、3)将所述iccg3硫酯肽与第二产物偶联得到第三产物；

42、4)将上述第一产物与第三产物偶联得到第四产物；

43、5)将上述第四产物与第五产物偶联得到所述塑料降解酶。

44、优选的，所述步骤1)中氧化采用的硫酯选自mpaa硫酯或mesna硫酯。

45、优选的，所述偶联采用自然化学连接反应完成。

46、在本发明的一些具体实施例中，所述偶联采用自然化学连接(ncl)反应完成。

47、所述步骤2)中ncl反应得到第一产物后，优选采用tfa脱除甘氨酸辅基；ncl反应得到第二产物后，优选采用哌啶脱除fmoc基团；ncl反应得到第五产物后，优选采用pdcl2脱除acm基团；ncl反应得到第四产物后，进行脱硫处理。

48、所述步骤5)ncl后优选采用tfa脱除hbm基团，制备得到全化学合成的塑料降解酶。

49、与现有技术相比，本发明提供的塑料降解酶及其镜像对映体的化学合成方法包括以下步骤：划分塑料降解酶序列，连接位点的氨基酸进行突变和保护，固相合成划分好的肽段，部分肽段氧化得到硫酯肽，自然化学连接技术连接多肽片段，制备得到塑料降解酶。所述化学合成方法采用收敛式合成，简单高效，成本低。通过固相多肽合成技术和自然化学连接技术制备得到纯度高、性能优良的塑料降解酶以及高酶解稳定性的镜像塑料降解酶，同时可以满足对塑料降解酶人工改造的需求，为塑料降解酶工业化生产提供了新思路，为摄入人体内的微塑料降解提供潜在途径。